肝癌中鐵死亡的調控因素及潛在應用進展

潘亞芳， 郭 瑋,2*

1. 復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032 2. 復旦大學附屬中山醫院廈門醫院檢驗科，廈門 361015

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的肝癌類型，是全球第二大癌癥死亡原因[1]。當前的HCC治療方法包括手術切除、局部消融、化學栓塞、肝移植和分子靶向治療[2]。只有少數肝癌患者在早期被發現，大多數患者則是在中晚期被診斷，而此時他們已失去手術治療的機會，這也是HCC患者死亡率高的重要原因。對于這些患者，他們迫切需要更有效的治療途徑。在癌細胞中誘導細胞毒性是癌癥治療的主要方法之一，但大多數研究都集中在細胞凋亡領域[3]。由于抗凋亡機制常使癌細胞對抗癌藥物產生耐藥性，因此誘導新形式的調節性細胞死亡(如鐵死亡)，對于開發新的治療實體腫瘤的方法具有很大的價值。

1 鐵死亡簡介

鐵死亡是在2012年被發現的一種調節性細胞死亡(regulatory cell death，RCD)[4]。在線粒體涉及鐵的氧化磷酸化過程中，細胞會產生活性氧類(ROS)，超過細胞抗氧化能力的ROS水平會導致氧化應激反應，從而直接或間接破壞蛋白質、核酸和脂質等大分子物質，導致細胞損傷或死亡[5]，即鐵死亡。

鐵死亡的主要過程：(1)細胞膜上的多不飽和脂肪酸(PL-PUFA-OH)可被脂氧合酶和ROS氧化，形成脂質過氧化物(PL-PUFA-OOH)；(2)在鐵離子存在下，PL-PUFA-OOH會轉化為有毒的脂質自由基，導致細胞膜脂質中多不飽和脂肪酸分解；(3)細胞最終會由于細胞膜破裂而死亡。不同于細胞凋亡和壞死，其形態學特征是細胞體積收縮、線粒體膜密度增加、嵴甚至消失，而沒有典型的凋亡、壞死和自噬表現[6](表1)。已發現鐵死亡存在于許多生理和病理疾病中，如神經退行性疾病[7]、缺血再灌注損傷[8]和一系列癌癥[9-11]。鐵死亡在肝癌的發生中起著重要作用[12]。鐵死亡可通過調節谷胱甘肽(glutathione，GSH)[13]、細胞內脂質過氧化物[14]及其他相關物質的水平影響肝癌的發生發展。鐵死亡可作為肝癌的診斷、預防和治療的靶標，已成為肝癌治療的研究熱點。

表1 調節性細胞死亡類型及其相關特征

2 參與肝癌鐵死亡的調控因子

最近在癌細胞中發現了幾種鐵死亡的調控因子。例如，谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4 ，GPX4)是哺乳動物中硒依賴性谷胱甘肽過氧化物酶的一個獨特成員，在抑制鐵死亡過程中，脂質活性氧的產生起著關鍵作用[15]。熱休克蛋白β-1(heat shock protein beta-1，HSPB1)，分子伴侶的成員，可調節肌動蛋白絲的動力學并減少鐵的吸收，從而促進鐵死亡[16]。p53則被發現，通過抑制SLC7A11的表達而成為鐵死亡的正向調節因子[17]。已知肝癌的發生和發展受多種細胞組分和細胞內信號通路的調節，而有關鐵死亡在肝癌中的詳細信號轉導途徑和關鍵轉錄調節因子尚在研究當中。鐵死亡在癌癥尤其是肝癌的治療中已展現出巨大的前景。

2.1 P62-Keap1-NRF2通路的激活抑制肝癌細胞中鐵死亡的發生 核因子紅系2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor，NRF2)是抗氧化反應的關鍵調節因子。在不受壓力的條件下，低水平的NRF2主要是由Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)介導的蛋白酶體降解來維持平衡。受癌癥的類型和階段影響，NRF2在癌癥的預防或治療中起著雙重作用。例如，NRF2會阻止化學致癌物或癌基因介導的致癌過程的發生；但若已經癌變，NRF2反而會加速癌變進展。NRF2的過度表達會抑制細胞凋亡，并在幾種癌癥中促進化學耐藥性。研究[18]證明，p62-Keap1-NRF2通路通過上調參與鐵和ROS代謝的多個基因[醌氧化還原酶1(NQO1)、血紅素氧合酶1(HO1)和鐵蛋白重鏈1(FTH1)]，在保護肝癌細胞免受鐵死亡中起著中心作用。

當暴露于誘導鐵死亡的化合物(如erastin、索拉非尼和丁硫氨酸亞砜亞胺)中時，p62的表達阻止NRF2降解，增強隨后的NRF2核積累。此外，核NRF2與轉錄輔激活因子小v-maf禽肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源蛋白(maf)相互作用，然后激活NQO1、HO1和FTH1的轉錄。因為NQO1、HO1和FTH1的敲除抑制了鐵死亡誘導后肝癌細胞的生長，這些NRF2的靶基因是鐵死亡的負調控基因。敲減肝癌細胞中p62、NQO1、HO1和FTH1，促進了erastin和索拉菲尼誘導的鐵死亡。同時基因或藥物對肝癌細胞NRF2表達/活性的抑制增強了體外和異種移植瘤模型中erastin和索拉菲尼的抗癌活性。這些均證實NRF2的狀態是決定肝癌細胞對鐵死亡靶向治療反應的關鍵因素之一。P62-Keap1-NRF2通路在鐵死亡中的功能特征可能為肝癌的治療提供新的思路。

2.2 Sigma-1受體(Sigma-1 receptor，S1R)對HCC細胞鐵死亡的保護作用 S1R是非阿片類受體蛋白。除了中樞神經系統外，S1R還存在于肝、胰腺和癌細胞中[19]。最近的研究報道顯示，S1R可能通過激活抗氧化反應元件并減少氧化的GSH和谷氨酸來抑制許多器官中ROS的產生。先前的研究表明，S1R通過調節NRF2-Keap1途徑和半胱氨酸/谷氨酸反向交換Xc-系統來調節ROS，這兩者均對鐵死亡至關重要。研究[20]證實，抑制S1R會調節GPX4、鐵代謝和ROS積累，可顯著阻斷erastin和索拉菲尼誘導的FTH1和TFR1的增加，表明S1R負性調節鐵代謝來阻止ROS的積累，且發現S1R的抑制增強了索拉非尼在體外和體內對HCC細胞的抗癌作用。除了引起活性氧的積累，肝臟中的鐵超載也是一種調節免疫系統的致癌因子。因此，鐵也可能在肝癌發生和癌細胞死亡中扮演雙重角色。

2.3 MicroRNA-214-3p靶向肝癌細胞中的ATF4增強erastin誘導的鐵死亡 MicroRNA長18～24個核苷酸且為內源性非編碼RNA分子，通過使信使RNA(mRNA)不穩定和/或抑制翻譯來調節基因表達[21]。MiR-214靶向多種基因(包括Catenin β1、肝癌衍生生長因子和Twist)在人類肝癌中發揮抗腫瘤作用。ATF4是內質網應激的重要因素，且被證明是鐵死亡的負調節因子，因此，ATF4的敲除可能使癌細胞易受鐵死亡的影響。miR-214-3p是ATF4的上游調節因素[22]。有研究人員[23]在2種肝癌細胞系中研究了miR-214對鐵死亡的作用。在體外，他們用erastin(鐵死亡誘導劑)處理穩定過表達miR-214可的HepG2和Hep3B細胞，發現miR-214增強erastin誘導的肝癌細胞脂質氧化作用，促進鐵死亡的發生且抑制ATF4的表達；在體內，他們對患有Hep3B異種移植腫瘤的裸鼠給予erastin，發現miR-214降低了腫瘤的生長，并降低了用erastin處理的裸鼠體內ATF4的表達。他們證實miR-214在肝癌細胞中促進鐵死亡的作用至少歸因于其對ATF4的抑制作用。

2.4 LncRNA-GABPB1-AS1和GABPB1在erastin誘導HepG2細胞鐵死亡過程中調節氧化應激 很少有研究探討長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)在細胞氧化應激調節中的作用，特別是在鐵死亡中。鐵死亡對鐵的依賴性提示過氧化物酶失活可能是鐵死亡的一個重要事件。過氧化物酶在鐵離子存在下可阻止過氧化氫產生羥基自由基，進而阻止ROS的積累。已知NRF2具有3個亞基(α、β和γ)，而GABPB1是NRF2的激活亞基。GABPB1與α亞基形成四聚體復合物，并刺激包括抗氧化劑基因過氧化物酶-5(PRDX5)在內的各種基因的轉錄。LncRNA GABPB1-AS1 是GABPB1 mRNA的反義RNA。研究[24]證明，erastin上調了lncRNA GABPB1-AS1，后者通過阻斷GABPB1翻譯下調了GABPB1蛋白水平，導致PRDX5基因下調，并最終抑制了細胞抗氧化能力，導致ROS和MDA的積累及HepG2細胞死亡。研究還發現，高表達水平的GABPB1與HCC患者的預后不良相關，而肝癌患者中高水平的GABPB1-AS1與總體生存期提高相關。這些發現揭示了GABPB1-AS1可能是erastin誘導HCC細胞鐵死亡的關鍵分子，豐富了對lncRNA調節氧化應激的認識。

3 鐵死亡參與肝癌的治療

在晚期肝癌患者中，手術和非手術治療均未獲得令人滿意的結果。幾種靶向藥物中只有索拉非尼和雷戈非尼被證明可以成功延長HCC患者的生存期[25-26]。索拉非尼是一種多激酶抑制劑，是提高HCC生存率的首個全身療法用藥，口服索拉非尼已成為美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的用于不可切除HCC患者的標準治療方法[27]。它能抑制腫瘤細胞的增殖、血管生成并可促進多種腫瘤的細胞凋亡[28]。最近，有研究[29]稱，索拉非尼可能會阻斷Xc傳輸系統，從而抑制GSH的合成，其作用機制與erastin類似。隨后，其他科研團隊[30]也證實索拉非尼可以誘導癌細胞的鐵死亡。

3.1 通過內源性途徑誘導HCC細胞鐵死亡

3.1.1 索拉非尼誘導HCC細胞鐵死亡 目前對索拉非尼針對HCC細胞的毒性作用機制已有初步認識。最初的報道[31]是索拉非尼可誘導HCC細胞的凋亡。然而，之后發現索拉非尼單藥應用于HCC細胞不能誘導與凋亡相關的主要線粒體事件，例如細胞色素C的胞質釋放或胱天蛋白酶的活化[32]。此外，索拉非尼只有與化合物ABT-737結合才能成為一種有效的凋亡誘導劑。Louandre等[33]研究發現，索拉非尼對HCC細胞的毒性作用可被鐵的有效化學螯合劑去鐵胺(DFX)阻止。因此，索拉非尼作為單一藥物應用于HCC細胞能夠誘導不同于凋亡的細胞死亡。與此同時，DFX賦予的保護取決于其耗盡HCC細胞內鐵存儲的能力。結果表明，索拉非尼應用于HCC細胞可以誘導某種形式的細胞死亡，該死亡與鐵死亡密切相關。總而言之，引發鐵死亡可能是提高索拉非尼在肝癌中療效的一種可行策略。

3.1.2 視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，Rb)蛋白調節索拉非尼在HCC細胞中引起的鐵死亡 Rb蛋白可調節真核生物中一些基因的轉錄[34]，且Rb蛋白以其在細胞增殖中的調節作用和在G1/S檢查點的關鍵作用而聞名，主要是其調節E2F家族轉錄因子活性的能力。已知Rb蛋白功能的喪失是肝癌發生過程中的一個重要事件，且針對Rb蛋白狀態是否為肝癌細胞對索拉非尼反應調節因素尚在研究中。重要的是，研究[30]表明，Rb蛋白的狀態是調節癌細胞對鐵死亡易感性的一個參數。低表達Rb的HCC細胞暴露于索拉非尼后，細胞死亡數增加2～3倍。索拉非尼治療的BALB/c裸鼠在接種低表達Rb的HCC細胞后所生長的異種移植腫瘤，與接種對照細胞的小鼠腫瘤穩定相比，在接受治療的動物中有50%的腫瘤完全消退。說明暴露于索拉非尼后，肝細胞癌的Rb蛋白陰性狀態會促進鐵死亡的發生。該發現突顯了Rb蛋白在HCC細胞中對于索拉非尼的應答和鐵死亡調節的作用。

3.1.3 磷酸調節信號參與索拉非尼治療HCC細胞誘導的鐵死亡 索拉非尼如何參與誘導肝癌細胞鐵死亡，一直是學者們的探索方向。Raf-Mek-Erk信號通路并不是索拉非尼誘導肝癌細胞鐵死亡的重要靶點，索拉非尼有一種獨特的作用方式來誘導鐵死亡[33]。由于已經提出索拉非尼與其他類似的激酶抑制劑相比具有抑制Xc-系統的額外活性[35]，因此更好地理解索拉非尼調節Xc-系統活性的磷酸化變化將有助于解釋索拉非尼等激酶抑制劑是如何誘導鐵死亡的。Werth等[36]的研究概述了索拉非尼治療對SKHep1細胞的早期作用：在藥物治療30 min內對蛋白質磷酸化有廣泛的調節作用，而在60 min的處理后作用會更加劇烈。這項研究包括對6 170個獨特磷酸位點的定量覆蓋，采用無標記定量(LFQ)磷酸蛋白質組學來探測磷酸化隨時間的變化。這包括Xc-的潛在結合位點上的磷酸位點，還包括已知與鐵死亡相關的蛋白質上的磷酸位點。根據他們的發現，在索拉非尼治療后，鐵穩態蛋白和其他與鐵死亡有關的蛋白上的許多位點都受到顯著的調節。這些均指出，在鐵死亡的誘導過程中可能涉及了磷酸化調節信號。

3.2 外源性途徑誘導肝癌細胞鐵死亡

3.2.1 雙GSH耗盡型索拉非尼負載錳硅納米藥物誘導肝癌細胞鐵死亡 GSH具有抗氧化和解毒能力，其水平與腫瘤進展和化療耐藥密切相關，而HCC細胞中GSH水平升高。因此，研究人員認為GSH耗竭策略將是治療HCC的理想方法之一。Tang等[37]介紹了一種新型一鍋反應，用于合成錳摻雜的介孔二氧化硅納米粒子(錳-二氧化硅納米粒子，MMSNs)，該反應可通過MMSNs降解引起細胞內GSH消耗來誘導腫瘤細胞的鐵死亡。MMSN的錳氧化鍵會在高GSH濃度下斷裂，從而迅速在環境中消耗GSH。1分子-Mn-O-的裂解將消耗2分子的GSH。因此，由MMSN的降解引起的GSH消耗效率足夠耗盡細胞內的GSH。同時，MMSNs的降解會導致負載的索拉非尼釋放，從而阻斷Xc-傳輸系統，在用MMSNs @ SO(MMSNs負載索拉非尼)孵育后，HCC細胞中的GSH含量迅速降低，并且抑制了GSH的合成。重要的是，MMSNs @ SO對正常肝細胞(LO2細胞)的毒性要比HCC細胞低得多。他們旨在通過構建MMSNs @ SO來雙向耗盡細胞內GSH而發揮優異的促鐵死亡作用。結果顯示，這種雙重消耗GSH的納米藥物具有誘導HCC細胞鐵死亡的巨大潛力，將有助于開發針對HCC的高效鐵死亡誘導劑。

但是，細胞可以適應不斷變化的微環境。當GSH被消耗時，GSH的合成將加速，連續的鐵死亡將被抑制[38]。因此，如何抑制肝癌細胞GSH的合成，是腫瘤治療中誘導鐵死亡的另一個關鍵點。

3.2.2 低密度脂蛋白二十二碳六烯酸納米粒誘導鐵死亡 Sawada等[39]的流行病學研究報告稱，富含多不飽和ω-3脂肪酸(ω-3PUFA)的飲食可降低肝炎患者發生HCC的風險。為此，研究人員[14]設計了一種用天然ω-3PUFA二十二碳六烯酸重構的低密度脂蛋白納米粒子(LDL-DHA)。LDL-DHA通過鐵死亡途徑誘導肝癌細胞死亡，這是其抗癌活性的一種新的分子機制。LDL-DHA納米顆粒對大鼠肝癌和人HCC細胞系均具有細胞毒性。LDL-DHA處理后，大鼠和人類HCC細胞在細胞死亡之前均經歷明顯的脂質過氧化，GSH枯竭和脂質抗氧化劑GPX4 失活。治療后的肝癌細胞死亡與凋亡、壞死或自噬途徑無關，與鐵依賴性細胞死亡機制一致，GPX4也是LDL-DHA誘導腫瘤細胞死亡的中樞調節因子。他們進一步研究了LDL-DHA對承載人肝癌移植瘤小鼠的影響。瘤內長期注射LDL-DHA會嚴重抑制HCC異種移植物的生長。與體外研究結果一致，LDL-DHA治療的HCC腫瘤經歷了鐵依賴性細胞死亡，其特征是組織脂質氫過氧化物水平升高和GPX4表達抑制。

LDL-DHA誘導的鐵死亡可實現有效的抗腫瘤效果，因為長期的腫瘤生長抑制作用在停止治療后仍可得到很好的維持。這些發現為LDL-DHA控制腫瘤細胞毒性的分子機制提供了新見解。

綜上所述，鐵死亡在HCC中起著至關重要的作用，鐵死亡是誘導肝癌細胞死亡的有效機制。同時，關于肝癌中鐵死亡的詳細信號轉導途徑仍在進一步探索中，而針對索拉非尼耐藥性、肝癌轉移和能量代謝等，都是將來探索的方向。鐵死亡可能成為肝癌藥物治療的靶標，為索拉非尼在腫瘤中的優化應用開辟新的途徑。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。