液相色譜串聯質譜法檢測雞肉粉中的 恩諾沙星和環丙沙星

◎ 崔 敏，張曉英，譚 瑋，董紅陽，燕娜娜

（山東省榮成市檢驗檢測中心，山東 榮成 264300）

喹諾酮類藥物作為一種廣譜抗菌藥物，抗菌活性強。其中恩諾沙星（Enrofloxacin）為合成的第三代氟喹諾酮類藥物，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有很好的抗菌作用，耐藥率低，口服效果顯著，血藥濃度高且穩定，能廣泛分布各組織，其代謝產物環丙沙星（Ciprofloxacin），仍有強大抗菌效果，在動物飼養、水產養殖和臨床上應用非常廣泛[1-2]。然而，由于近些年抗生素的濫用問題，已經引起了社會廣泛關注。在食用農產品安全問題上，美國、歐盟和我國等許多國家已經制定了相關限量標準對喹諾酮類藥物進行了殘留量的限定[3]。

雞肉粉作為一種食品配料，廣泛應用于調制湯料、方便營養調料、鮮味香精、膨化食品等制品的生產[4]，因此雞肉粉中獸藥殘留的監管不容忽視。雞肉粉作為質控樣品介質，將待測分析物加入其中，常用于實驗室檢測能力的評估及分析方法的確認[5]。本研究參照GB/T 20366—2006、GB/T 21312—2007， SN/T 1751.2—2007、農業部1025號公告14-2008和農業部1077號公告-1-2008[6-10]的檢測方法，借助三重四極桿液相色譜串聯質譜法對雞肉粉中恩諾沙星和環丙沙星的殘留量的檢測進行方法優化，綜合各標準方法優點建立了一種準確、快捷、簡便的測定方法，能夠準確測定恩諾沙星和環丙沙星的含量，為雞肉粉中恩諾沙星和環丙沙星的檢測方法提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

恩諾沙星、環丙沙星、恩諾沙星-D5、環丙沙星-D8為有證標準物質（北京壇墨質檢科技股份有限公司）；甲醇、乙腈、正己烷（歐普森，色譜純）；鹽酸、氫氧化鈉、甲酸、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉和檸檬酸（國藥集團化學試劑北京有限公司），實驗室用水符合GB/T 6682—2008規定的一級水。

雞肉粉空白樣品、雞肉粉中恩諾沙星（標準值376 μg·kg-1，擴展不確定度53 μg·kg-1，k=2）殘留分析標準物質GBW10152（簡稱ZKE）、雞肉粉中環丙沙星（標準值456 μg·kg-1，擴展不確定度55 μg·kg-1，k=2）殘留分析標準物質GBW10153（簡稱ZKC）：農業農村部農產品標準研究中心。

1.2 儀器與設備

三重四極桿液相色譜-串聯質譜儀：TSQ Quantum Ultra EMR System，美國賽默飛世爾科技公司；電子分析天平：AR224CN，±0.0001 g，上海天平儀器廠；高速冷凍離心機：CF16RXⅡ，日本日立；渦旋混合器：Vortex I，IKA；氮吹儀：MTN-5800，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；超純水系統：MOL PW500EDI，重慶摩爾水處理設備有限公司；C18色譜柱：Hypersil gold（C18）100 mm×2.1 mm 1.9 μm，Thermo；超聲波發生器：KQ-300TDB，昆山市超聲儀器有限公司；HLB固相萃取柱：6 mL/500 mg，CNW；60 mL注射器：山東新華安得醫療用品有限公司；固相萃取柱轉接頭。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液的配制

1 μg·mL-1的混合標準工作液；準確吸取100 μg·mL-1的恩諾沙星標準溶液和100 μg·mL-1的環丙沙星標準溶液各1 mL，于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，配制成10 μg·mL-1的混合標準中間液；準確吸取10 μg·mL-1的混合標準中間液1 mL，于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，配制成濃度為1 μg·mL-1的混合標準工作液。

100 ng·mL-1的混合內標工作液：準確吸取 1 mL 100 μg·mL-1的恩諾沙星-D5標準溶液和1 mL 100 μg·mL-1的環丙沙星-D3標準溶液，于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，配制成10 μg·mL-1的混合標準中間液，依次逐級稀釋，至濃度為100 ng·mL-1的混合內標工作液。

0.2 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液：稱取71.63 g磷酸氫二鈉，用水溶解，定容至1000 mL。

0.1 mol·L-1的檸檬酸溶液：稱取21.01 g檸檬酸，用水溶解，定容至1000 mL。

0.1 mol·L-1的EDTA-Mcllvaine緩 沖 溶 液：將 1000 mL 0.1 mol·L-1檸檬酸溶液與625 mL 0.2 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液混合，氫氧化鈉或鹽酸調節pH至4.0±0.05，加入60.5 g乙二胺四乙酸二鈉，溶解混勻之后備用。

含5 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸溶液：稱取 0.3854 g乙酸銨，用水溶解并稀釋至1000 mL，加入1 mL甲酸，混勻。

1.3.2 樣品前處理

提取：準確稱取試樣0.5 g（精確到0.001 g），于50 mL的聚丙烯離心管中，加1.8 mL水充分混合復原，加100 μL 100 ng·mL-1的混合內標工作液，加入20 mL 0.1 mol·L-1的EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，均質。超聲提取10 min，10000 r·min-1離心5 min（4 ℃），提取3次，合并上清液。

凈化：HLB固相萃取柱（500 mg，6 mL），使用前6 mL甲醇洗滌，6 mL水活化。安裝轉接頭和 60 mL注射器，將上清液轉移至注射器，控制流速以2～ 3 mL·min-1速度過柱，6 mL 5%甲醇水淋洗，6 mL甲醇洗脫，收集洗脫液。40 ℃氮氣吹干，準確加入1 mL（根據實測濃度可調整定容體積）含有10%甲醇的0.1%甲酸水溶液和4 mL正己烷，超聲1 min后渦旋混勻，10000 r·min-1離心5 min（4 ℃），取下層水相過0.22 μm微孔濾膜，上機待測。

1.3.3 標準曲線的繪制

為降低基質效應影響，提高試驗準確性，本研究采用了雞肉粉空白樣品，與樣品同步進行前處理，作為空白基質。添加質量濃度為10 ng·mL-1的內標工作液，將混合標準工作液逐級稀釋成1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10 ng·mL-1、15 ng·mL-1、20 ng·mL-1、30 ng·mL-1、40 ng·mL-1、50 ng·mL-1、60 ng·mL-1和70 ng·mL-1的工作曲線。

1.3.4 儀器條件

色譜條件。C18色譜柱，柱溫：30 ℃，流動相：溶劑A（含5 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸溶液），溶劑B（甲醇+乙腈=4+6）；流速：0.25 mL·min-1；梯度洗脫條件：0～1 min 5%B，1～3 min 5%B→95%B，3～8 min 95%B，8～10 min 5%B。

質譜條件。ESI源，多反應監測（MRM），氬氣為碰撞氣；毛細管溫度（℃）：350，鞘氣（Arb）：45，輔助氣（Arb）：10，噴霧電壓（V）：3000，離子掃描模式：正離子掃描模式。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

取1 μg·mL-1的恩諾沙星、恩諾沙星-D5、環丙沙星和環丙沙星-D8混合標準溶液，在液相質譜聯用儀ESI+模式下掃描，優化質譜條件，選擇信號強度理想的母離子和子離子作為定性定量離子，篩選結果見表1。

表1 化合物的質譜條件表

2.2 離子流圖和線性方程

上機檢測，化合物總離子流圖和提取離子流圖結果見圖1，恩諾沙星和環丙沙星的出峰時間分別為 4.47 min和4.38 min，恩諾沙星和環丙沙星系列標準工作液均為1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10 ng·mL-1、15 ng·mL-1、20 ng·mL-1、30 ng·mL-1、40 ng·mL-1、50 ng·mL-1、60 ng·mL-1和70 ng·mL-1，該標準曲線的線性回歸方程分別為：Y=-0.032908 1+0.129126X和Y=-0.442433+0.26663X，相關系數R2為0.9979和0.9983，線性良好，恩諾沙星和環丙沙星的線性曲線如圖2所示。

圖1 化合物總離子流圖和提取離子圖

圖2 恩諾沙星和環丙沙星的線性曲線圖

2.3 加標回收率和精密度

雞肉粉空白樣品中，加入恩諾沙星和環丙沙星混合標準溶液，選擇在5.0 μg·kg-1，20 μg·kg-1，80 μg·kg-13水平進行加標回收試驗，按照文中方法進行前處理，每個添加濃度測定6次，同時測定陽性質控樣品（ZKE和ZKC），平均加標回收率和精密度結果如表2所示，平均回收率為89.9%～101.6%，精密度為0.9%～7.2%，陽性質控樣品ZKE和ZKC的實測值分別為346 μg·kg-1和475 μg·kg-1，結果均在其擴展不確定度范圍內，符合檢測需求。

表2 樣品平均回收率和精密度實驗結果表

2.4 檢出限和定量限

取恩諾沙星和環丙沙星加標量為5.0 μg·kg-1的樣品經前處理后上機測定，根據3倍信噪比確定方法的檢出限，按10倍信噪比確定方法的定量限，結果顯示恩諾沙星的檢出限和定量限分別為0.50 μg·kg-1和 1.3 μg·kg-1，環丙沙星的檢出限和定量限分別為 1.0 μg·kg-1和2.5 μg·kg-1。

2.5 定量方法的選擇

3水平加標樣品和陽性質控樣品（ZKE和ZKC）采用外標法定量計算，外標法定量結果見表3，外標法回收率范圍為80.6%～94.0%，ZKE和ZKC的實測值分別為331 μg·kg-1和428 μg·kg-1，與內標法定量結果比對發現外標法定量結果偏低，而內標法定量更準確，因此本方法選擇內標法定量。

表3 外標法定量結果表

3 結論

本文通過試驗對雞肉粉中恩諾沙星和環丙沙星的液相色譜-質譜聯用測定法進行了優化，選擇EDTAMcllvain緩沖溶液作為提取液，減少了有機溶劑的使用，借助轉接頭安裝60 mL注射器的HLB固相萃取柱凈化樣品提取液，簡化了多次進樣的凈化過程，提高了工作效率，且有效去除了干擾雜質，延長色譜柱的使用壽命，避免色譜質譜系統的污染。同時采用空白基質配制標準工作曲線，降低了基質效應，提高了定性和定量的準確性，該方法前處理簡單快速、線性良好，回收率和精密度高，內標法校正，可以更準確定量測定雞肉粉中恩諾沙星和環丙沙星的含量，滿足檢測需求。