余甘子提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

◎ 劉賢釗，陳炎歡，羅蘭芳，覃日金，李美珍

（無(wú)限極（中國(guó)）有限公司，廣東 江門(mén) 529100）

余甘子是大戟科植物余甘子（Phyllanthus emblicaL.） 的干燥成熟果實(shí)[1]，是一種藥食同源的果實(shí)。余甘子提取物（Phyllanthus emblicaExtract）是以余甘子為原料，經(jīng)水提取、過(guò)濾、濃縮、干燥等工序制成的提取物[2]。余甘子提取物在我國(guó)主要作為膳食補(bǔ)充劑，廣泛用于食品、保健食品行業(yè)。余甘子提取物中含有沒(méi)食子酸、鞣花酸等成分[3-5]，現(xiàn)代藥理研究表明，余甘子提取物具有提高免疫力[6]、抗氧化[7]、輔助保護(hù)肝損傷[8-9]等作用。目前，在國(guó)內(nèi)外均未有余甘子提取物的官方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，僅有余甘子生品及鹽制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一些初步研究[10]。由于余甘子提取物的質(zhì)量指標(biāo)沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)可遵循，其質(zhì)量要求差異大，產(chǎn)品質(zhì)量無(wú)法保證，不利于行業(yè)發(fā)展。本研究對(duì)13批不同產(chǎn)地的余甘子提取物進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，初步建立余甘子提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為其規(guī)范化生產(chǎn)及質(zhì)量控制提供科學(xué) 依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

余甘子提取物由適量余甘子藥材加8倍量水煎煮3次，合并濾液，70 ℃減壓濃縮，經(jīng)噴霧干燥而得。13批余甘子提取物來(lái)源于4個(gè)廠家，編號(hào)1～13。沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)149-91-7，批號(hào)110831-201906，中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量以91.5%計(jì)）；鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)476-66-4，批號(hào)111959-201903，中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量以88.8%計(jì)）；甲醇為色譜純（德國(guó)Merck公司）；其他試劑均為分析純，水為純化水。

1.2 儀器與設(shè)備

HP1200 型高效液相色譜儀（包括二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司），KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 感官測(cè)定

取本品嗅其氣味、嘗其滋味；另取試樣適量置于白色瓷盤(pán)中觀察其色澤、外觀，并檢查有無(wú)異物。觀察發(fā)現(xiàn)13批余甘子提取物為黃棕色至深褐色干燥均勻粉末，色澤均勻，具有余甘子特有的氣味，無(wú)異味，無(wú)正常視力可見(jiàn)外來(lái)異物。

1.3.2 薄層色譜鑒別

（1）對(duì)照品溶液配制。分別取5.0 mg沒(méi)食子酸溶解于1.0 mL 70%乙醇中，1.0 mg鞣花酸溶解于 50.0 mL70%乙醇中，分別制成0.5 mg·mL-1沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液和0.02 mg·mL-1鞣花酸對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液配制。取本品粉末約0.2 g，置于具塞錐形瓶中，加入70%乙醇30 mL，超聲（250 W，40 kHz）處理30 min，取出放冷，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

（3）薄層色譜測(cè)定。分別吸取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液2 μL，鞣花酸對(duì)照品溶液20 μL，供試品溶液2～ 10 μL，點(diǎn)于同一硅膠板上，以二氯甲烷-甲酸-乙酸乙酯-水（7∶2.5∶2∶0.5，體積比）的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，在100～105 ℃下加熱至斑點(diǎn)或條帶顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同的熒光斑點(diǎn)。

1.3.3 理化指標(biāo)測(cè)定

水分按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》（GB 5009.3—2016）的第一法進(jìn)行測(cè)定。灰分按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》（GB 5009.4—2016）規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。粒度按照《中華人民共和國(guó)藥典（2020版）》第四部通則中“粒度和粒度分布測(cè)定法”第二法（篩分法）進(jìn)行測(cè)定，過(guò)100目篩。

1.3.4 沒(méi)食子酸的含量測(cè)定

（1）對(duì)照品溶液制備。精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品約3 mg于10 mL的棕色容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，即得對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液制備。取本品約0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱(chēng)定重量，超聲（250 W，40 kHz）提取1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

（3）色譜條件。色譜柱：十八烷基鍵合硅膠柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相：以甲醇為流動(dòng)相A，以0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；波長(zhǎng)273 nm；柱溫30 ℃；流速 1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL；理論塔板數(shù)按沒(méi)食子酸計(jì)不低于5000。

表1 梯度洗脫條件表

（4）線性關(guān)系考察。精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品18.842 mg置25 mL容量瓶中，按1.3.4中（1）項(xiàng)下制備方法加50%甲醇溶解制成儲(chǔ)備液，再精密吸取該儲(chǔ)備液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL和10.0 mL分別至10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，按1.3.4中（3）項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定峰面積。

（5）精密度試驗(yàn)。精密稱(chēng)取1.3.4中（1）項(xiàng)下制備的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液（濃度0.2737 mg·mL-1），重復(fù)進(jìn)樣6次。

（6）穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密稱(chēng)取余甘子提取物（批號(hào)20191202/12591）按1.3.4中（2）項(xiàng)下制備的供試品溶液，按1.3.4中（3）項(xiàng)下色譜條件分別于0 h、2 h、4 h、6 h、12 h和24 h測(cè)定。

（7）重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱(chēng)取余甘子提取物（批號(hào)20191202/12591）同一天內(nèi)按1.3.4（2）項(xiàng)下制備的6份供試品溶液，按1.3.4中（3）項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

（8）回收率試驗(yàn)。精密稱(chēng)取余甘子提取物（批號(hào)20191202/12591，沒(méi)食子酸含量為9.75%）精密稱(chēng)定約0.1 g于9個(gè)具塞錐形瓶中。另取沒(méi)食子酸對(duì)照品（純度90.8%）112.26 mg置50 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容（此對(duì)照品溶液含沒(méi)食子酸 2.0386 mg·mL-1），分別吸取該對(duì)照品溶液2.5 mL（以沒(méi)食子酸計(jì)5.0966 mg）、5.0 mL（以沒(méi)食子酸計(jì)10.1932 mg）、7.5 mL（以沒(méi)食子酸計(jì)15.2898 mg），分3組加入含樣品的9個(gè)具塞錐形瓶中，按1.3.4中（2）項(xiàng)下制成供回收率測(cè)定用供試品溶液，按1.3.4中（3）項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算沒(méi)食子酸的回收率。

（9）樣品含量測(cè)定。分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。根據(jù)所得對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖中沒(méi)食子酸峰面積計(jì)算供試品中待測(cè)組分沒(méi)食子酸含量。

1.3.5 重金屬指標(biāo)測(cè)定

重金屬指標(biāo)按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測(cè)定》（GB 5009.268—2016）第一法電感耦合等離子質(zhì)譜法（ICP-MS）規(guī)定的方法測(cè)定鉛、砷、鎘、汞含量。

1.3.6 微生物檢查

菌落總數(shù)的測(cè)定按《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》（GB 4789.2—2016）規(guī)定的方法進(jìn)行；霉菌和酵母的測(cè)定按《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）規(guī)定的方法進(jìn)行；大腸埃希氏菌的測(cè)定按《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）檢驗(yàn)大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)規(guī)定的方法進(jìn)行。沙門(mén)氏菌的測(cè)定按《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016）規(guī)定的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官測(cè)定

觀察發(fā)現(xiàn)13批余甘子提取物為黃棕色至深褐色干燥均勻粉末，色澤均勻，具有余甘子特有的氣味，無(wú)異味，無(wú)正常視力可見(jiàn)外來(lái)異物。

2.2 薄層色譜鑒別

S1為沒(méi)食子酸；S2為鞣花酸。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 余甘子提取物薄層色譜圖

2.3 理化指標(biāo)

余甘子提取物水分、灰分、粒度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 余甘子提取物水分、灰分、粒度測(cè)定結(jié)果表

2.4 沒(méi)食子酸的含量測(cè)定

2.4.1 線性關(guān)系考察

按1.3.4（4）操作，以沒(méi)食子酸對(duì)照品的濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：Y=556.45X-0.121，R2=0.9999。結(jié)果表明沒(méi)食子酸在0.0684～0.6843 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

按1.3.4（5）操作，分別計(jì)算峰面積及保留時(shí)間的RSD值，保留時(shí)間和峰面積的RSD值均為0.06%。不對(duì)稱(chēng)度以沒(méi)食子酸計(jì)不高于1.2。理論塔板數(shù)，以沒(méi)食子酸計(jì)約21000，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按1.3.4（6）操作，供試品中沒(méi)食子酸峰面積的RSD為0.24%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

按1.3.4（7）操作，沒(méi)食子酸平均含量為9.75%，RSD為1.00%。分離度大于1.5，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 回收率試驗(yàn)

按1.3.4（8）操作，沒(méi)食子酸平均回收率為98.85%（92%～105%），RSD值為1.63%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。余甘子提取物沒(méi)食子酸含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 余甘子提取物沒(méi)食子酸含量測(cè)定結(jié)果表

2.5 重金屬指標(biāo)

余甘子提取物鉛、砷、鎘、汞測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 余甘子提取物鉛、砷、鎘、汞測(cè)定結(jié)果表（單位：mg·kg-1）

2.6 微生物指標(biāo)

余甘子提取物微生物檢查結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 余甘子提取物微生物檢查結(jié)果表

（續(xù)表5）

3 結(jié)論

根據(jù)對(duì)13批次的余甘子提取物進(jìn)行感官測(cè)定、薄層色譜鑒別、理化指標(biāo)測(cè)定、沒(méi)食子酸含量測(cè)定、微生物檢查和重金屬指標(biāo)測(cè)定結(jié)果，結(jié)合食品和藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定原則、相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及產(chǎn)品特性、市場(chǎng)要求制定本標(biāo)準(zhǔn)初步制定了余甘子提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見(jiàn)表6。本研究初步建立的余甘子提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高了其質(zhì)量評(píng)價(jià)的客觀性與專(zhuān)屬性，為進(jìn)一步規(guī)范余甘子提取物生產(chǎn)、銷(xiāo)售行業(yè)提供科學(xué) 依據(jù)。

表6 余甘子提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)表