氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜水果中三氯生及甲基三氯生

張春雨

三氯生是一種家庭廚衛(wèi)和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品中使用較多的抗菌劑，從2016年開始，歐盟及美國等國家均已禁止將其應(yīng)用于洗護(hù)產(chǎn)品[1]。含有三氯生的藥物及洗護(hù)用品，隨著人們使用過程中生活污水的排出而排放到水生環(huán)境中，并穩(wěn)定存在于污水、污泥和地表水中，是一種新興的污染物[2]。甲基三氯生的脂溶性和毒性作用較強(qiáng)，如果在農(nóng)田或果園中施入含有三氯生和甲基三氯生的沉積物肥料或污水，可增加蔬菜和水果中的三氯生和甲基三氯生污染風(fēng)險(xiǎn)，從而影響食用者的身體健康[3]。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是臨床檢測(cè)三氯生和甲基三氯生的常用方法，本研究于2020年9月1日—10月31日，采用上述方法對(duì)蔬菜水果中的三氯生和甲基三氯生含量進(jìn)行了檢測(cè)，以便了解蔬菜水果的污染情況，從而更好地評(píng)估農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

本研究實(shí)驗(yàn)于2020年9月1日—10月31日開展，所使用儀器包括氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、氮吹儀、超聲波清洗機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、高速冷凍離心機(jī)、理化干燥箱、電子天平、多管旋渦混合儀。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

（1）三氯生標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：稱取5.0 mg的TCS標(biāo)準(zhǔn)品，使用甲醇將其溶解至100 mg/L，轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中后，使用甲醇對(duì)其進(jìn)行定容后，混合均勻并密封，保存于4℃條件下。

（2）甲基三氯生標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：稱取5.0 mg的MTCS標(biāo)準(zhǔn)品，使用甲醇將其溶解至100 mg/L，轉(zhuǎn)移至容量瓶中后使用甲醇定容，混合均勻后保存于4℃條件下作為儲(chǔ)備液。

（3）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：選取適量三氯生和甲基三氯生標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，使用甲醇將其稀釋到0.4 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L和20.0 μg/L的混合溶液，保存在4℃條件下。

（4）制備濃度為99.5%的三氯生標(biāo)準(zhǔn)品和98.9%的甲基三氯生標(biāo)準(zhǔn)品；制備體積比為99：1的三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷混合溶液作為衍生試劑，選用的甲醇和乙酸乙酯均為色譜純。

1.3 儀器工作條件

色譜條件：使用DB-17MS毛細(xì)管色譜柱，進(jìn)樣品溫度為280℃，進(jìn)樣體積1 μL，毛細(xì)管色譜柱參數(shù)為30 m×0.25 mm，0.25 μm，以純度為99.99%的氦氣為載氣，不分流進(jìn)樣，流量設(shè)置為14 mL/min。進(jìn)行毛細(xì)管色譜柱升溫程序設(shè)計(jì)，初始溫度150℃，維持1 min后，按照25℃/min的速度對(duì)其進(jìn)行升溫，待其溫度上升至250℃后按照5℃/min的速度使其上升至260℃。達(dá)該溫度后以30℃/min的速度繼續(xù)升溫至290℃，并維持1 min。操作過程中總的運(yùn)行時(shí)間為9 min。

質(zhì)譜條件：采用電子轟擊離子源，設(shè)置電離能量為70 eV，離子源溫度250℃，應(yīng)用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，溶劑延遲3 s，將傳輸線溫度控制在250℃。

1.4 試驗(yàn)方法

本研究水果選取蘋果、橙子，蔬菜選取黃瓜和西紅柿作為樣品，橙子去皮后切成小塊，蘋果、黃瓜及西紅柿均切塊，勻漿后保存于-22℃條件下備用。每種樣品均稱取5.0 g，將其置入離心管中，加入乙酸乙酯10 mL后，以2 500 r/min的速率對(duì)其進(jìn)行2 min的轉(zhuǎn)速勻漿，超聲提取10 min后，以10 000 r/min的速度進(jìn)行離心處理，10 min后取出上層有機(jī)相至雞心瓶，并對(duì)下層殘?jiān)M(jìn)行二次提取，將獲得的2次提取液同樣裝入雞心瓶中。對(duì)該瓶中的提取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，待其近干后，使用乙酸乙酯對(duì)雞心瓶進(jìn)行洗滌，重復(fù)2次后取洗滌液至玻璃離心管中，對(duì)其吹氮至近干，并加入體積比為99：1的三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷混合溶液，于60℃環(huán)境下，使其進(jìn)行硅烷化衍生化反應(yīng)，衍生結(jié)束后吹氮至近干，并使用乙酸乙酯對(duì)殘?jiān)M(jìn)行溶解，獲得待測(cè)液后按照相關(guān)工作條件對(duì)其實(shí)施測(cè)定。

1.5 觀察指標(biāo)

觀察樣品在色譜-質(zhì)譜條件下，掃描后的質(zhì)譜圖，計(jì)算并記錄三氯生、甲基三氯生的先性方程、檢出限等情況，并分析該方法檢測(cè)的精密度和回收率。

2 結(jié)果

2.1 樣品前處理

在實(shí)際測(cè)定過程中，由于三氯生在進(jìn)樣口的靈敏性較低，而在色譜柱中往往具有較高反應(yīng)性，很容易造成其色譜峰出現(xiàn)拖尾的情況，進(jìn)而對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。甲基三氯生作為三氯生的甲基化產(chǎn)物，在進(jìn)行衍生化反應(yīng)時(shí)應(yīng)避免應(yīng)用甲基化試劑，所以本研究采用了硅烷化衍生試劑對(duì)三氯生進(jìn)行改性，其具體衍生化反應(yīng)過程如下圖1所示。

圖1 三氯生的衍生化反應(yīng)

本次試驗(yàn)中在將衍生物反應(yīng)殘留物用氮?dú)獯蹈珊?，選用子酸乙酯對(duì)其茶渣進(jìn)行溶解，能夠有效減少前處理過程中，因試劑轉(zhuǎn)換所導(dǎo)致的干擾效應(yīng)，能夠增強(qiáng)檢測(cè)方法的兼容性。通常情況下，在對(duì)樣品進(jìn)行提取和濃縮等處理后，需要對(duì)其進(jìn)行凈化處理，如畜產(chǎn)品和水產(chǎn)品，由于所含有的脂肪和蛋白質(zhì)成分較多，通常需要對(duì)其先進(jìn)行凈化處理，然后再對(duì)其進(jìn)行分析。而本次試驗(yàn)測(cè)定的蔬菜和水果，因其基質(zhì)成分相對(duì)較為簡單，所以樣品在經(jīng)提取和濃縮等處理后，可不再進(jìn)行凈化處理。

2.2 定性鑒別兩種物質(zhì)

2.2.1 全掃描模式 通過對(duì)三氯生衍生物和甲基三氯生實(shí)施一級(jí)質(zhì)譜全掃描，將質(zhì)荷比（m/z）設(shè)置在50～500，于70 e電離能量轟擊下，獲得相應(yīng)的一級(jí)質(zhì)譜圖，并確定其分子離子與碎片離子的m/z，其一級(jí)質(zhì)譜圖如圖2所示。通過分析可以發(fā)現(xiàn)，三氯生衍生物經(jīng)一級(jí)質(zhì)譜掃描后，分子離子的m/z為360.99，離子豐度最高的m/z為346.95，如圖2（a）。甲基三氯生的以及質(zhì)譜圖顯示分子離子m/z為304，豐度最高的離子為303.97，如圖2（b）所示，主要為甲基三氯生喪失一個(gè)甲基和一個(gè)氯之后所得。

圖2 三氯生衍生物與甲基三氯生的全掃描一級(jí)質(zhì)譜圖

通過將三氯生衍生物m/z 360.99、甲基三氯生m/z 303.97分別對(duì)應(yīng)的分子離子作為母離子，對(duì)其實(shí)施二級(jí)質(zhì)譜全掃描，可進(jìn)一步獲得與之對(duì)應(yīng)的特征子離子，以保障對(duì)目標(biāo)物鑒定的專屬性，其二級(jí)質(zhì)譜圖如圖3所示，其豐度最高的子離子分別對(duì)應(yīng)為m/z 347.25和m/z 254.23。

圖3 三氯生衍生物碎片m/z 362與甲基三氯生特征碎片的二級(jí)質(zhì)譜圖

2.2.2 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式 通過在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下，掃描得出三氯生衍生物、甲基三氯生的母離子后，使用10 V的碰撞解離電壓，對(duì)其進(jìn)行碰撞解離，然后經(jīng)掃描得出相對(duì)應(yīng)的子離子，從而得到目標(biāo)物的特征離子對(duì)。確定掃描程序：對(duì)三氯生衍生物掃描時(shí)間0～6.1 s，母離子m/z 362，子離子m/z 347。甲基三氯生掃描時(shí)間6.11～9.00 s，母離子m/z 360，子離子m/z 254，利用MRM掃描程序?qū)θ壬苌铩⒓谆壬幕旌先芤哼M(jìn)行掃描，獲得的總離子流色譜圖（見圖4）。

圖4 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流色譜圖

2.3 線性參數(shù)及檢出限情況

應(yīng)用MRM模式對(duì)前面配置的不同濃度（0.4～20.0 μg/L）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示這兩種物質(zhì)的質(zhì)量濃度在0.4～20.0 μg/L，與相應(yīng)的峰面積之間具有線性相關(guān)關(guān)系，具體如表1所示。

表1 兩種物質(zhì)的線性參數(shù)及檢出限

2.4 精密度與回收試驗(yàn)結(jié)果

通過在本研究所選取的四種樣本中，加入濃度為0.02 μg/kg、0.10 μg/kg和1.00 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，均平行測(cè)定6次后，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率，得出的結(jié)果如表2所示。

表2 精密度與回收試驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品分析

隨機(jī)從市場(chǎng)上選購若干蔬菜水果，蔬菜選擇土豆、西紅柿、黃瓜，水果選擇蘋果、橘子和獼猴桃，采用上述試驗(yàn)方法對(duì)這些樣品中的三氯生和甲基三氯生含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，在西紅柿樣品中檢測(cè)出了這兩種物質(zhì)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.208 ng/g和0.087 ng/g，其檢出率均為2.8%。

3 討論

三氯生以往是家庭廚衛(wèi)與個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品中使用較多的抗菌劑，但隨著歐盟等西方國家嚴(yán)禁將其作為抗菌劑應(yīng)用于洗護(hù)產(chǎn)品后，三氯生在我國的使用也受到了越來越多的關(guān)注。含有三氯生的相關(guān)產(chǎn)品，能夠通過污水排放至水生環(huán)境，進(jìn)而對(duì)水環(huán)境造成污染，屬于新興污染物之一。三氯生通過光化學(xué)反應(yīng)和氯化反應(yīng)后，可生成二噁英、三氯甲烷等毒性成分，給生態(tài)環(huán)境造成影響[4]。有研究報(bào)道，三氯生作為一種具有抗菌活性的醚類，在進(jìn)入生物機(jī)體后，能夠?qū)ζ鋬?nèi)分泌造成不同程度的干擾，破壞哺乳動(dòng)物、魚類和兩棲動(dòng)物在內(nèi)多物種的內(nèi)分泌功能，影響這些物種的生長發(fā)育和繁衍等功能，從而導(dǎo)致其發(fā)育畸形，具有較強(qiáng)的氧化應(yīng)激和神經(jīng)毒性作用[5-7]。甲基三氯生是三氯生經(jīng)微生物甲基化后生成的降解產(chǎn)物，具有較三氯生更強(qiáng)的持久性、親脂性和毒性作用，可更廣泛地分布[8-9]。在日常農(nóng)田和果園管理過程中，如果將含有三氯生和甲基三氯生沉積物的肥料或污水施入到在農(nóng)田或果園，可增加蔬菜和水果的三氯生、甲基三氯生污染風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)食用者的身體健康造成極大威脅[10]。因此，采取有效方法對(duì)蔬菜水果中的這些毒性成分進(jìn)行檢測(cè)極為重要，可直接關(guān)系到食品質(zhì)量安全。

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是當(dāng)前檢測(cè)三氯生和甲基三氯生的主要手段[11]，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法通過對(duì)三氯生進(jìn)行衍生化反應(yīng)，能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為弱極性衍生物，更方便對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)，是一種較為可靠的理化檢驗(yàn)方法，可應(yīng)用于蔬菜水果污染情況測(cè)定，在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)中具有重要作用[12]。有研究報(bào)道，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)蔬菜水果中的乙烯利、殘留農(nóng)藥等進(jìn)行檢測(cè)，均具有較好的檢測(cè)效果，能夠?yàn)槭卟怂仁称钒踩珯z測(cè)提供重要幫助，能夠更好地保障消費(fèi)者權(quán)益[13-14]。由于目前關(guān)于蔬菜、水果中三氯生、甲基三氯生含量測(cè)定的相關(guān)研究報(bào)道較少，故本研究中采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)蔬菜水果中的這些物質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè)。本次實(shí)驗(yàn)通過對(duì)隨機(jī)獲取的蔬菜、水果樣品中目標(biāo)物含量應(yīng)用上述方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示濃度在0.4～20.0 μg/L，兩種目標(biāo)物均具有良好線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.99以上，檢出限在4～5 ng/kg，且在不同加標(biāo)水平下，各種蔬菜水果的回收率在92.8%～108.0%，精密度在3.5%～12.8%，能夠滿足相關(guān)檢測(cè)要求。

總之，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有操作簡便，精密度高，檢出限低等優(yōu)勢(shì)，將其應(yīng)用于蔬菜水果的三氯生、甲基三氯生含量測(cè)定，穩(wěn)定性和靈敏性良好，能夠更好地了解蔬菜水果的污染情況，為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)提供重要依據(jù)。