柯薩奇病毒B組5型感染的人惡性胚胎橫紋肌肉瘤細胞系lncRNA表達譜分析

滕培英，李 靜，師玉露，楊 帆，歐 霞，陳 偉

(昆明理工大學 醫學院， 云南 昆明 650500)

柯薩奇病毒B組5型(Coxsackie virus group B type 5，CVB5)屬小RNA病毒科腸道病毒屬，無包膜，基因組為單股正鏈RNA[1]。CVB5是引起手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)的主要病原體之一，主要感染5歲以下嬰幼兒，臨床癥狀通常表現為發熱，黏膜皮疹和皰疹等，病情嚴重者會導致無菌性腦膜炎和急性弛緩性麻痹等神經性并發癥，乃至死亡。近年來，由CVB5感染導致的HFMD呈爆發流行趨勢，對幼兒健康造成了嚴重威脅[2-4]。然而，目前尚無針對CVB5感染引起HFMD的有效治療手段和預防措施。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNA)是轉錄本長度大于200個核苷酸且不具備蛋白編碼功能的非編碼RNA總稱，具有導向、海綿、分子誘餌以及與蛋白質相互作用等多種生物學功能[5]。同時，越來越多的研究證明，lncRNA與病毒-宿主之間存在密切關系[6-7]。病毒感染宿主細胞后，可引起宿主編碼lncRNA的差異表達，它們通過調控免疫信號通路、病毒基因組轉錄翻譯和宿主細胞代謝產物等方式發揮了重要作用[8-9]。

LncRNA在腫瘤的研究中已有大量的報道應用，然而關于lncRNA與病毒-宿主相互作用機制研究尚處于起步階段。因此，本研究通過分析CVB5感染人惡性胚胎橫紋肌肉瘤細胞系RD(human malignant embryonic rhabdomyosarcoma cell line，RD)，細胞中差異lncRNA表達譜，從而為深入研究lncRNA調控CVB5與宿主之間的相互作用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：DMEM(Hyclone公司)，RNAiso Plus、One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa公司)。

1.1.2 細胞及病毒：人惡性胚胎橫紋肌瘤肉瘤細胞系RD(中國科學院昆明細胞庫)及CVB5病毒均由本實驗室保存。RD細胞接種于含有10% FBS的DMEM完全培養基，37 ℃、5% CO2培養箱培養。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備：1×106個RD細胞鋪于6孔板中，待細胞完全貼壁后，1×PBS緩沖液洗2次，換為含2% FBS的DMEM維持液，使用感染復數(multiplicity of infection，MOI)為1的CVB5感染RD細胞，在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察RD細胞的細胞病變效應(cytopathic effects，CPEs)。

1.2.2 CVB5 TCID50的測定：取增殖狀況良好的RD細胞，1×PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化細胞。按每孔3×104個細胞加入96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養箱培養過夜。第2天，用DMEM維持液將病毒液按10倍的梯度進行稀釋，稀釋至10-1～10-12，按每孔50 μL病毒液加入過夜培養的細胞中，每個稀釋度4個復孔，同時設置空白對照。蓋上蓋子做好標記，37 ℃、5% CO2培養箱連續培養7 d，每天觀察并記錄CPE。第7天，統計病變情況并根據Reed Mench法計算病毒滴度。

1.2.3 RNA提取及轉錄組測序技術(RNA sequencing，RNA-seq)：1MOI CVB5接種RD細胞24 h后，收集細胞，使用Trizol法提取總RNA。采用分光光度計Nanodrop檢測總RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳及Agilent 2100檢測RNA完整性。采用RNA-Seq PE150策略進行lncRNA表達圖譜分析(由北京諾和致源公司完成)。

測序完成后，獲得CVB5感染RD細胞lncRNA表達圖譜。隨后，采用去除核糖體RNA的方法構建cDNA文庫，Qubit2.0進行初步定量，Aglient2100對文庫質量進行評估。以相對表達量變化倍數(fold change，FC)>2，P<0.05作為差異顯著基因的篩選標準，篩選得到的差異mRNA和lncRNA進行數據分析。

同時，使用Cuffdiff和ClusterProfiler軟件對差異lncRNA進行聚類分析、GO分析和KEGG富集等生物信息學分析。

1.2.4 RT-qPCR驗證差異lncRNA的表達：對篩選得到的差異性顯著lncRNA進行實時熒光定量(quantitative real-time PCR，RT-qPCR)驗證，反應程序為：42 ℃，5 min反轉錄為cDNA；95 ℃預變性10 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火/延伸34 s，40個循環。使用2-△△Ct方法分析RNA的相對表達水平。引物名稱及其序列(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 二級結構的預測：采用RNAfold軟件對篩選的lncRNA二級結構進行預測，從而更好的預測lncRNA保守性及潛在結合區域。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CVB5感染RD細胞模型建立

1MOI CVB5感染RD細胞0、6、12、24、48和60 h時，通過測定病毒TCID50(半數組織培養感染劑量，median tissue culture infective dose)可知，CVB5感染24 h時，TCID50值最高(圖1A)。同時，CPE結果顯示，與對照細胞相比，CVB5感染24 h后，細胞產生顯著CPE(圖1B)。

2.2 差異mRNA和lncRNA表達分析

與對照組相比，CVB5感染RD后，共獲得4 860個差異表達的mRNAs(1 754個mRNAs上調表達和3 106個mRNAs下調表達)和1 268個lncRNAs(508個lncRNAs上調表達和760個lncRNA下調表達)(轉錄組數據庫No.GSE180816)。表2顯示了CVB5感染后RD細胞中20個上調和下調最顯著的lncRNA。對所有差異mRNA和lncRNA聚類分析結果表明，與對照組相比，CVB5感染RD細胞后，宿主細胞中mRNA和lncRNA表達圖譜均發生了顯著變化(圖2)。

A.RD cells were inoculated with the CVB5, and supernatant cultuers were collected at 6, 12, 24, 48 and 60 hours post-infection and virus titers were determined using TCID50; B.typical CPEs caused by RD infected with CVB5 were observed and photographed using inverted microscope at 24 hours post-infection

表2 CVB5感染的RD細胞中20個上調和20個下調最顯著的lncRNATable 2 20 most significantly each up-regulated and down-regulated lncRNAs in CVB5 infected RD cells

Compared with the control group, clustering profiles of mRNA (A) and lncRNA (B) expression in RD cells infected with CVB5; red represented genes with increased expression, and blue represented genes with decreased expression

2.3 LncRNA與mRNA特征比較

與mRNA相比，lncRNA轉錄本長度主要集中在5 kb以內，外顯子個數小于10個，ORF長度小于300個核苷酸(圖3)。

2.4 GO分析和KEGG通路富集預測lncRNA生物功能

與下游靶基因共表達的lncRNA主要富集在結構分子活性、細胞因子活性和嗅覺感受過程等20個顯著富集的GO條目中(圖4A)；差異表達lncRNA靶基因主要參與嗅覺傳導途徑、細胞因子受體相互作用和神經活性配體受體相互作用等20條顯著富集通路(圖4B)。

2.5 RT-qPCR檢測lncRNA表達水平

對隨機選擇的7個lncRNA進行驗證，lncRNA表達水平與RNA-seq結果一致(圖5)。

2.6 LncRNA二級結構預測

通過預測7個lncRNA的二級結構，鑒定了lncRNA的假結和莖環結構，標尺藍色(0)至紅色(1)表示堿基配對概率(圖6)。

3 討論

隨著測序技術的不斷發展，lncRNA在病毒與宿主相互作用中起著重要的作用。多種病毒感染宿主細胞后，可以引起宿主lncRNA的差異表達是一種普遍現象[10-11]。因此，研究lncRNA在病毒感染與復制中的作用機制，對病毒性疾病的診斷預防及治療具有重要意義。對于同屬且引起HFMD的重要病原體中， 在腸道病毒71(entero virus 71，EV71)感染RD細胞和小鼠骨骼肌中分別發現了23個和104個差異表達的lncRNA。進一步對差異lncRNA進行生物學功能和通路富集顯示，lncRNA可能通過調節免疫應答，與蛋白質結合，生物代謝等途徑參與EV71感染過程[12]。此外，有研究將柯薩奇病毒A16(Coxsackie virus A16，CVA16)感染RD細胞后鑒定出60個上調表達和1 210個下調表達的lncRNA。通過預測差異lncRNA的二級結構、修飾作用和順反式功能等，初步闡明了病毒致病機制[13]。然而，關于CVB5感染后差異lncRNA表達情況及如何調控病毒與宿主相互作用尚未可知，仍需進一步驗證。

圖3 LncRNA與mRNA特征比較Fig 3 Comparison of lncRNA and mRNA characteristics

圖4 GO和KEGG分析差異表達lncRNA高度富集基因的相關生物學途徑Fig 4 Analyzing biological pathway that differentially expressed lncRNA highly enriched genes by GO and KEGG

A.validation results of qPCR; B.primary results of RNA-seq圖5 RT-qPCR驗證RNA-seq結果Fig 5 Comparisons of RT-qPCR with RNA-seq results

圖6 利用RNAfold軟件對lncRNA二級結構預測Fig 6 Secondary structures prediction of lncRNAs were performed using RNAfold software

本研究首先成功構建了CVB5感染RD細胞的模型，隨后通過RNA-seq分析，獲得了1 268個差異表達lncRNA，且在多種生物學過程被富集，包括分子結構活性、蛋白質分子結合和體液免疫反應等生物過程，其主要參與嗅覺傳導途徑、細胞因子受體相互作用和神經活性配體受體相互作用通路等過程。由于lncRNA具有較長的核苷酸序列，其復雜的二級結構通過與蛋白或核酸相互作用發揮多種功能，如在MALAT1中，高度保守的富含尿嘧啶的區域通過形成三重螺旋而有助于RNA穩定[14]；LncRNA MEG3由于兩個次級折疊基序的存在從而可發揮抑制腫瘤的功能[15]。因此，lncRNA的特定二級結構與其生物學功能具有重要關系。本研究挑選了經RT-qPCR驗證正確的7個lncRNA二級結構進行了預測，結果表明lncRNA具有保守的二級結構，可能通過與蛋白質、DNA或RNA相互作用發揮生物學調控作用，但其編碼能力有待進一步驗證。

CVB5感染后可導致HFMD及中樞神經系統損失，嚴重者甚至死亡。然而關于CVB5感染復制的機制還有待進一步闡明。本研究旨在探索CVB5感染RD細胞后差異表達lncRNA表達譜變化以及對差異顯著lncRNA的結構功能預測，從而為后續研究lncRNA如何調控病毒與宿主之間的相互作用奠定基礎，同時為CVB5感染引起疾病的防治提供一種新思路。