探討沉默LncRNA-H19 聯合小劑量冬凌草甲素對APL 細胞增殖和凋亡的影響

單曉英，張祥華，王 巖

莒縣中醫醫院，山東 莒縣 276500

白血病（acute myeloid leukemia，AML）是兒童最常見的癌癥之一，約占兒童癌癥病例總數的25%～35%［1］。急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）作為AML 的亞型之一，其特征在于染色體15和17之間的相互平衡易位，將早幼粒細胞白血病（promyelocytic leukemia，PML）基因與維甲酸受體（retinoic acid receptor α，RARα）基因融合并導致白血病表型［2-3］。自全反式維甲酸和三氧化二砷被引入APL的治療以來，患兒的總生存率有了顯著提升，然而，對這兩種藥物耐藥的復發/難治性患兒的治療仍是臨床上有待解決的難題［2］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一組堿基數超過200 且與白血病關系密切的非編碼RNA，它們通過與蛋白質、miRNA 或基因組DNA 相互作用而介導白血病細胞增殖、凋亡、分化、侵襲等［3］。其中，H19 已被證實能夠有效預測AML 預后，是潛在的白血病治療靶點［4］。冬凌草甲素（Oridonin）是一種從唇形香茶屬植物冬凌草中提取的四環二萜類化合物，在多種白血病細胞中表現出抑制細胞增殖、促進細胞凋亡和逆轉細胞耐藥性等活性［5-7］。但小劑量冬凌草甲素在干預APL 中的效果有限且機制尚未完全闡明，故本研究擬探討沉默LncRNA-H19 聯合小劑量冬凌草甲素對APL 細胞NB4 增殖和凋亡的影響并分析其可能機制，以期為APL 的藥物治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4（中國科學院上海細胞庫）；冬凌草甲素（純度＞98%，北京環宇生物技術有限公司，批號：20180726，用二甲基亞砜配制成10 mmol/L 母溶液）；胎牛血清（美國Gibco公司，批號：1635367）；羅斯韋爾公園紀念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）培養基（美國Gibco 公司，批號：8118352）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司，批號：1864617）；Trizol（美國Invitrogen公司，批號：501751108）；逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain Reaction，RT-PCR）試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號：1908366）；Annexin V 細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司，批號：9009901；碘化丙錠染料（美國Sigma 公司，批號：1696417）；細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）、細胞增殖檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：113119201486）；放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：272631736124）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：001203766845）。

1.2 主要儀器電子天平［瑞士梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司］；恒溫CO2培養箱（美國Thermo Fisher Forma 公司）；Milli-Q Plus 純水器（法國Millipore 公司）；流式細胞儀（美國Backman 公司）；Real-time PCR 分析儀（美國ABI公司）；電泳儀（美國BioRad公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養與分組將NB4 細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基中培養，培養條件：5%CO2、37℃、飽和濕度。每天換液1 次，每2 天傳代1 次，取對數生長期細胞進行實驗。將細胞分為對照組（未經任何處理）、LncRNA-H19 siRNA 組（沉默LncRNA-H19）、冬凌草甲素組（用5 μmol/L冬凌草甲素處理）、聯合干預組（轉染LncRNA-H19 siRNA后，用5 μmol/L冬凌草甲素處理）。

1.3.2 轉染采用Lipofectmine 2000將LncRNAH19 siRNA 轉染至NB4 細胞，轉染6 h 后換新鮮的RPMI-1640 培養基繼續培養細胞，直至48 h 收取細胞，提取RNA測定LncRNA-H19表達情況。

1.3.3 RT-PCR法檢測細胞中LncRNA-H19表達用Trizol 試劑提取細胞中的總RNA 并逆轉錄合成cDNA，再用cDNA 作為模板合成擴增目的基因，采用β-actin 作為內參照基因。反應條件為95℃預變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火30 s，共40 個循環。LncRNA-H19 基因的上游引物序列為：5′-CTACAGCTTACTTCAAGGCCAG-3′；下游引物序列為5′-TCAGAGACAGTCAAGCGGTAT-3′。β-actin 的上游引物序列為：5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′；下游引物序列為5′-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。

1.3.4 CCK-8 法檢測細胞增殖能力取處于對數生長期的正常細胞或LncRNA-H19 siRNA 細胞，接種于96 孔板上，密度6×103個細胞/孔。各組分別采用相應的干預措施，將培養板置于培養箱中培養96 h。在0、24、48、72和96 h，每孔加入10 μL的CCK8 溶液，于37℃持續孵育2 h，再用酶標儀在450 nm處檢測吸光度。實驗重復3次。

1.3.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況取處于對數生長期的正常細胞或LncRNA-H19 siRNA 細胞，接種于6 孔板上，密度為5×105個細胞/孔。各組分別采用相應的干預措施，將培養板置于培養箱中培養24 h 后收集細胞，以1500 r/min 離心5 min，棄上清液，用PBS 漂洗3 次，棄上清液。再將細胞重懸浮于200 μL 的Bingding Buffer，并分別加入10 μL 的Annexin V-FITC 和5 μL 的碘化丙錠染料，混勻，于25℃避光反應15 min。最后加入300 μL 的Bingding Buffer，1 h 內上流式細胞儀檢測。

1.3.6 Western Blot 法檢測細胞中目的蛋白表達水平取處于對數生長期的細胞并接種于6 孔板上，密度為5×105個細胞/孔。各組分別采用相應的干預措施，將培養板置于培養箱中培養24 h后收集細胞，用RIPA裂解液處理細胞，并采用BCA法定量總蛋白濃度。以每孔30 μg 上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉PVDF 膜，用5% 脫脂奶粉封閉液于25℃封閉1 h 后分別加入兔抗人β-catenin（1∶2000）、兔抗人Cyclin D1（1∶2000）、兔抗人兔抗人C-myc（1∶2000）、兔抗人PI3K（1∶2000）、兔抗人AKT（1∶2000）單克隆抗體，于4℃孵育過夜。用TBST 漂洗3 次后，加入辣根過氧化物標記的山羊抗兔IgG，于37℃孵育30 min，用ECL發光劑顯影。采用Quantity One 軟件分析條帶灰度值，選擇β-actin作為上樣內參。

目的蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值

1.4 統計學方法采用SPSS 21.0統計學軟件分析數據，組間比較采用One-Way ANOVA 分析，兩組間比較采用LSD 分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 沉默LncRNA-H19 和冬凌草甲素對NB4 細胞中LncRNA-H19 表達的影響與對照組比較，LncRNA-H19 siRNA 組和聯合干預組NB4 細胞中LncRNA-H19 表達量顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；冬凌草甲素組NB4 細胞中LncRNA-H19表達量無明顯變化（P＞0.05）。見圖1。

圖1 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素對NB4細胞中LncRNA-H19表達的影響

2.2 沉默LncRNA-H19 和冬凌草甲素對NB4 細胞增殖的影響與對照組比較，LncRNA-H19 siRNA組和聯合干預組24、48、72 和96 h 以及冬凌草甲素組48、72 和96 h 的細胞增殖抑制率顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。聯合干預組細胞增殖抑制率明顯高于LncRNA-H19 siRNA組和冬凌草甲素組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素對NB4細胞增殖的影響

2.3 沉默LncRNA-H19 和冬凌草甲素對NB4 細胞凋亡的影響與對照組比較，LncRNA-H19 siRNA組、冬凌草甲素組和聯合干預組細胞凋亡率明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；聯合干預組細胞凋亡率明顯高于LncRNA-H19 siRNA組和冬凌草甲素組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素對NB4細胞凋亡的影響

2.4 沉默LncRNA-H19 和冬凌草甲素對NB4 細胞中凋亡相關蛋白表達的影響與對照組比較，LncRNA-H19 siRNA 組和聯合干預組NB4 細胞中β-catenin、Cyclin D1、C-myc、PI3K 和AKT 蛋白表達量顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；冬凌草甲素組NB4細胞中僅有PI3K蛋白表達量明顯降低（P＜0.05）。聯合干預組細胞中凋亡相關蛋白表達率明顯低于LncRNA-H19 siRNA組和冬凌草甲素組。見圖4—8。

圖4 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素對NB4細胞中β-catenin蛋白表達的影響

圖5 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素對NB4細胞中Cyclin D1蛋白表達的影響

圖6 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素對NB4細胞中C-myc蛋白表達的影響

圖7 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素對NB4細胞中PI3K蛋白表達的影響

圖8 沉默LncRNA-H19和冬凌草甲素對NB4細胞中AKT蛋白表達的影響

3 討論

APL 是一種以骨髓中早幼粒細胞增多為特點的髓系白血病［8］。雖然砷劑的應用能夠有效提高APL 的治愈率，但其作為一種毒性物質，短期可引起胃腸道反應、神經系統、心臟和肝臟損傷，在患兒中的長期安全性也有待考證［9］。

冬凌草甲素是冬凌草最重要的活性成分，既往研究表明其具有一定的抗白血病作用，已明確的作用機制包括調控轉移、凋亡相關蛋白MMP、Bax、Bcl-2表達［7］、增加細胞活性氧水平進而穩定RARα蛋白［10］、觸發伴侶蛋白介導的白血病BCR-ABL蛋白酶體降解［5］、激活NF-κB、mTOR/P70、RAF/ERK、STAT5 信號通路等［11］。冬凌草甲素的抗腫瘤效應呈劑量和時間依賴性。張曉芬等［12］報道1、2、4 μg/mL冬凌草甲素對急性T淋巴細胞白血病jurkat細胞增殖的抑制率分別為10.80%、32.32%、42.27%，本研究結果也顯示用5 μmol/L 冬凌草甲素干預24、48、72 和96 h 后對NB4 細胞的抑制率僅為6.63%、11.72%、18.09和25.38%，抑制率偏低。

LncRNA-H19 位于人染色體p15.5，是首個被鑒定的印記LncRNA，具有高度保守性，出生后除骨骼肌和心臟外，在其他組織中幾乎無表達，但在應激狀態或腫瘤發生時重新啟動表達［13］。在AML細胞系HL-60、THP-1 和U937 中，LncRNA-H19 促進腫瘤細胞增殖并抑制腫瘤細胞凋亡［14］。然而，LncRNA-H19 對APL 細胞的影響未見相關報道，其在白血病中的作用機制仍未完全明確。在本研究中，與對照組NB4細胞比較，LncRNA-H19沉默組細胞中的LncRNA-H19 表達明顯降低，細胞增殖率明顯降低，凋亡率明顯增加，提示沉默LncRNA-H19具有抑制APL 發生發展的作用。聯合干預組細胞增殖抑制率和凋亡率高于LncRNA-H19 siRNA組合冬凌草甲素組，說明沉默LncRNA-H19 聯合冬凌草甲素能夠有效抑制APL細胞增殖，促進細胞凋亡。

細胞增殖和凋亡受到多種腫瘤相關因子的調控。Wnt/β-catenin是介導腫瘤形成的關鍵通路，當細胞發生癌變時，β-catenin 磷酸化降解受阻，在細胞質中大量蓄積并轉入細胞核，其與相關轉錄因子結合，激活下游的cyclin D1、C-myc等效應分子轉錄，誘發細胞異常增殖和凋亡抵抗，促使細胞惡性轉化［15］。Cyclin D1是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因，在細胞周期進程中呈周期性變化，通過與其他蛋白相互作用而促進細胞進入S期，進而促進細胞分裂和增殖［16］。C-myc作為致癌基因，是決定細胞由GO/G1進入S期的“開關”，其編碼的蛋白與細胞增殖密切相關。C-myc 在血液腫瘤中高表達并與高增殖率、侵襲性表型、耐藥以及不良預后相關［17］。PI3K/AKT信號通路通過一系列的級聯反應調節下游相關蛋白的活化過程，介導細胞增殖和凋亡，研究表明在白血病中存在該通路的異常激活，是抗白血病治療的靶點之一［18-20］。在本研究中，LncRNA-H19 siRNA 組和聯合干預組細胞中β-catenin、Cyclin D1、C-myc、PI3K 和AKT蛋白表達量以及冬凌草甲素組細胞中PI3K蛋白表達量顯著低于對照組，而聯合干預組細胞中的以上蛋白表達量又低于LncRNA-H19 siRNA組或冬凌草甲素組，說明沉默LncRNA-H19 聯合冬凌草甲素通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路及其下游因子Cyclin D1、C-myc以及PI3K/AKT信號通路抑制APL進展，且效果優于LncRNA-H19 或冬凌草甲素單一干預法，尤其是明顯優于低劑量冬凌草甲素。