不同抗凝劑對犬血細胞分析的影響

殷勤凱，馬志強，于晶鳳，劉學龍

1.延吉市小營鎮(zhèn)綜合服務中心，吉林延吉 133000；2.延吉市畜牧站，吉林延吉 133000；3.延吉市動物衛(wèi)生檢疫站，吉林延吉 133000；4.延邊大學農(nóng)學院，吉林延吉 133000

隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術進步發(fā)展，全血細胞分析儀得到廣泛應用，血常規(guī)檢查方便許多，其優(yōu)點在于采血量少、分析項目多、分析時間短、準確率高等[1]。由于EDTA-K2的造價比較高，因此用EDTA-Na2代替做此次血細胞分析檢測的抗凝劑，但注意EDTA-Na2溶解性能差，混合時間應適當延長[2]。它對血液中的鈣離子有較好的結合能力，經(jīng)過膜離子通道進入PLT膜內(nèi)。由于EDTA-Na2螫合作用強于拘椽酸鈉絡合鈣離子，因此EDTA-Na2對防止血液中PLT因各種因素而發(fā)生凝集有一定的作用，并對PLT計數(shù)影響較小，穩(wěn)定性較好。

血常規(guī)檢驗過程中易發(fā)生各種錯誤，檢測時要注意采集的血液為靜脈血；檢查前一天晚上，禁止給犬飼喂任何食物；血液與抗凝劑的比例適當；血液的稀釋達到符合試驗的標準；血液在2～8 ℃可保存24 h。

1 材料與試劑

1.1 樣本

延邊大學動物醫(yī)院實驗犬，靜脈抗凝血，共10份。

1.2 試劑

RBC稀釋液、1%鹽酸溶液、復方尿素稀釋液、0.1 mol/L鹽酸溶液、淋巴細胞分離液等。

1.3 儀器

改良紐巴氏計數(shù)板、顯微鏡、計數(shù)器、高速離心機、動物血液分析儀等。

2 方法

2.1 檢測方法

分析不同抗凝劑對血液成分中六項參數(shù)結果的影響，以EDTA-K2抗凝計數(shù)結果為對照，進行統(tǒng)計學分析。

2.2 紅細胞計數(shù)

取一支小試管，用吸管吸3.98 mL紅細胞稀釋液，加入試管中。

用血紅蛋白吸管吸取20 μL血樣，然后將其插入盛有稀釋液的試管底部，吹出血液，吸吹數(shù)次，最后試管口加塞，顛倒混合數(shù)次，即得200倍的稀釋血液。

充液。取潔凈的計數(shù)板和血蓋片，將血蓋片放在計數(shù)板的計數(shù)室上。用吸管吸取少量已稀釋好的血液，以45°角置于計數(shù)板與血蓋片交界的邊緣，使血液擴散入計數(shù)室內(nèi)。

計數(shù)。充室后靜止3 min，用低倍鏡計數(shù)紅細胞。

2.3 白細胞計數(shù)

試管稀釋法：用血紅蛋白吸管吸取被檢血至20 mm3處，插入到裝有0.38 mL白細胞稀釋液試管的底部，反復吹出血液，以洗凈管內(nèi)附著的白細胞，充分混勻，即得20倍的稀釋血液。

充液。同紅細胞計數(shù)法。

計數(shù)。與紅細胞計數(shù)類似，不同的是將計數(shù)室四角上的四個大方格內(nèi)的白細胞依次全部計數(shù)完。

2.4 血小板計數(shù)

取稀釋液0.38 mL置于小試管中。

用血紅蛋白吸管吸取20 mm3加有抗凝劑的新鮮靜脈血，吹入試管，充分混勻。靜置20 min，使紅細胞溶解。

充入。用毛細吸管吸取上述稀釋好的血液，充入計數(shù)室內(nèi)。靜置10～20 min，用高倍鏡觀察。

計數(shù)。高倍鏡下精確計數(shù)紅細胞計數(shù)區(qū)的血小板數(shù)。

2.5 血紅蛋白測定

往測定管內(nèi)加入0.1 mol/L鹽酸至“20”刻度處。

用血紅蛋白吸管吸取20 μL血液，用紗布拭去管壁外及管尖黏附的血液，插入裝有鹽酸的試管底部，吹入試管，反復吸吹數(shù)次，輕輕搖晃，充分混勻，靜置5～10 mim，使其充分的酸化。

沿著管壁加入蒸餾水，稀釋至與標準比色板顏色相同時為止，讀取測定管內(nèi)液柱凹面的刻度值，即讀取血紅蛋白的百分數(shù)或克數(shù)。

2.6 動物血液分析

按照儀器操作方法對抗凝血進行分析。

3 結果

3.1 檢測結果

不同抗凝劑的血細胞測定結果見表1。

表1 不同抗凝劑血細胞參數(shù)測定結果統(tǒng)計值

從表1可知，采血抗凝后直接行血細胞檢驗，經(jīng)t檢驗分析：WBC計數(shù)、RBC計數(shù)、Hb、HCT此4項參數(shù)在3種抗凝劑組間無顯著性差異（p＞0.05）；與EDTA-Na2抗凝組相比，使用肝素和拘椽酸鈉時PLT計數(shù)降低，且有顯著性差異（p＜0.05）。

3.2 紅細胞體積檢測結果

使用不同抗凝劑的紅細胞平均體積測定結果見表2。

表2 不同抗凝劑紅細胞平均體積測定結果

從表2可知，不同的抗凝劑對紅細胞的體積有較大的影響，且影響結果不同。與枸櫞酸鈉抗凝的血液相比，使用肝素的血液的紅細胞體積較大，但EDTA-Na2對RBC體積的影響最大。

4 討論

血常規(guī)檢驗就是對血液中的白細胞、紅細胞及血小板這3個系統(tǒng)的量和質(zhì)進行檢測與分析。

實驗結果表明，大多數(shù)抗凝劑對紅細胞形態(tài)影響不大，不同的抗凝劑對紅細胞的結果影響不明顯。肝素與枸櫞酸鈉抗凝血的結果顯示，血小板數(shù)量降低。

血小板計數(shù)的降低可能與放置的時間有關，理論上，在采集血液15～30 min對標本進行測驗，因為在這段時間的檢驗是最為精確的，如果血液放置時間過長，會導致巨大血小板不斷地產(chǎn)生，而這種巨大血小板主要分布于紅細胞直方圖的100～250 FL處，結果會導致測定的血小板數(shù)低于實際血小板的數(shù)量，這樣也會造成血小板計數(shù)結果低于實際血小板數(shù)量的嚴重后果，紅細胞平均容積就會高出實際容積。抗凝劑的質(zhì)量對血小板的計數(shù)也會有一定的影響，若是出現(xiàn)凝塊現(xiàn)象，存在的雜質(zhì)會隨著被檢測的血液進入計數(shù)池內(nèi)，而對血小板的計數(shù)造成影響。血小板的體積與數(shù)量對其測定也有一定的影響，要保證血小板的體積維持在正常狀態(tài)，以其確保其測得結果的準確性，當體積異常增多時對血小板會有很大的影響。此外，在操作過程中切勿間斷對全血標本的混勻處理，所有的測定操作都必須在2 h內(nèi)完成。

本實驗通過采用血小板計數(shù)板對血細胞參數(shù)進行檢測，在計數(shù)的過程中存在一定的誤差，但計數(shù)未超過犬血細胞參數(shù)的正常范圍，反映了血常規(guī)的檢驗為犬在健康狀態(tài)的評估、疾病診斷提供了可靠的數(shù)據(jù)。

5 結論

5.1 在犬血細胞的分析檢測中，肝素、枸櫞酸鈉、EDTA-Na2對犬WBC、RBC、Hb 3項參數(shù)差異不顯著，無統(tǒng)計學意義；EDTA-Na2對PTL計數(shù)差異不顯著，肝素和枸櫞酸鈉使PTL計數(shù)下降，具有顯著性差異。

5.2 可用EDTA-Na2代替EDTA-K2作為抗凝劑，但EDTA-Na2溶解性能差，混合時間應適當延長，以保證抗凝的效果。

5.3 EDTA-Na2、肝素和枸櫞酸鈉都能使RBC的體積增大，與枸櫞酸鈉抗凝的血液相比，使用肝素的血液的紅細胞體積較大，但EDTA-Na2對RBC體積的影響最大。