腫瘤微環境中免疫與基質細胞相關基因在肺腺癌中的預后價值

李世雄，耿華，徐美林

（1.天津醫科大學胸科臨床學院，天津 300041;2.天津市胸科醫院病理科，天津 300300）

肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌。非小細胞肺癌又可分為兩種主要病理亞型，即鱗狀細胞癌和腺癌。在肺腺癌中，約25%的腫瘤中檢測到表皮生長因子受體（EGFR）突變和EML4-ALK重排。此外，還有一些罕見的肺癌驅動基因，如ROS1、RET、BRAF等。基于基因組研究和分子通路分析，靶向治療和臨床試驗取得快速進展[1]。近年來，免疫治療在肺癌患者中的應用越來越廣泛。免疫檢查點抑制劑，如細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4（CTLA-4）和程序性死亡1（PD-1）證明了治療效應和安全性[2]。雖然肺腺癌患者已有多種治療方式，但患者預后仍較差。因此，迫切需要為肺腺癌患者尋找新的、有效的、更準確的預后生物標志物。

腫瘤微環境（TME）由多種成分組成，包括基質細胞、腫瘤成分、先天免疫細胞和獲得性免疫細胞[3]。近年來，越來越多的研究表明患者不同的腫瘤微環境特性在介導晚期轉移、免疫逃逸和免疫治療抑制中發揮著重要作用?；|細胞和免疫細胞是TME中的兩種非腫瘤成分[4]。TME中的免疫細胞與惡性腫瘤細胞直接作用或通過細胞因子和趨化因子信號轉導相互作用，進而影響腫瘤的生物學行為和治療反應。基質細胞是TME中的另一重要細胞，有研究表明，基質細胞與腫瘤細胞之間存在著動態、雙向、復雜的關系[5]。Yoshihara等[6]通過分析TME中免疫細胞和基質細胞特異性基因表達水平，首創了一種名為ESTIMATE的算法來計算腫瘤患者的基質、免疫評分，利用該評分來預測非腫瘤細胞的浸潤情況。目前已有相關報道將ESTIMATE應用于胃癌[7]，揭示了這種基于大數據的算法的有效性。

在本研究中，筆者對肺腺癌患者臨床病理數據以及基質和免疫評分進行相關性分析。根據肺腺癌患者的基質和免疫評分高低篩選出差異表達基因，對差異基因構建相互作用網絡并進行富集分析。最后利用生存分析篩選出一組TME相關基因預測肺腺癌患者的預后。

1 資料與方法

1.1 數據收集和預處理 501例肺腺癌患者的基因表達數據來自癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫。數據中女性患者270例（53.9%），男性患者231例（46.1%），年齡38～89歲。利用Illumina平臺分析肺腺癌RNA表達譜，所有數值均用log2轉換。使用每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段（FPKM）對在TCGA數據庫中注釋的19 745個蛋白編碼基因進行表達定量。臨床資料包括性別、年齡、組織學分級、TNM分期、臨床分期、生存時間和隨訪結局。此外，丟失臨床病理信息或生存數據的樣本將被刪除。

1.2 基質和免疫評分ESTIMATE評分系統包括基質評分和免疫評分。評分基于TCGA數據庫中肺腺癌患者的基因表達情況。評分可以通過在線網站（https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease）下載。ESTIMATE算法可以通過分析腫瘤樣本的轉錄組數據推斷在TME中基質細胞和免疫細胞的浸潤情況。

1.3 臨床病理特征與基質、免疫評分之間的相關性根據臨床病理特征對患者進行分組，分析各組基質和免疫評分高低差異，χ2檢驗分析基質、免疫評分與臨床病理特征之間的相關性。用評分的中位數將這些樣本分為高基質評分組、低基質評分組，免疫評分同前分為兩組，采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗分析兩組總生存率的差異。

1.4 篩選差異表達基因將肺腺癌患者樣本分為兩組，即高基質（或免疫）評分組和低基質（或免疫）評分組。以基因表達差異倍數變化>2.0和P<0.01作為篩選差異表達基因（DEGs）的臨界值。使用TBtools將DEGs顯示在熱圖上（https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases）[8]。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建利用基因相互作用檢索工具（STRING，https://string-db.org/）[9]檢索DEGs的相互作用網絡。并通過Cytoscape軟件（版本3.7.2）進行基因相互作用的可視化[10]。然后使用Cytoscape的分子復合體檢測（Mcode）插件，根據拓撲原理尋找最重要的模塊即為連接最密集的區域。選擇設置為MCODE分數>5，度截斷值=2，節點截斷值=0.2，最大深度=100，k-分數=2。

1.6 基因本體論和KEGG通路富集分析可用于基因注釋、可視化和集合探索的數據庫（DAVID v.6.8）被用來進行基因的富集分析[11]。對基質評分組差異基因和免疫評分組差異基因分別進行細胞成分、分子功能、生物過程等基因本體論分析和KEGG通路的富集分析。FDR校正后的P<0.05被認為在基因本體論分析和KEGG通路富集分析中具有統計學意義。

1.7 關鍵基因的生存分析采用log-rank方法評價關鍵基因的預后價值。與肺腺癌患者總生存率顯著相關的基因被確定為預后相關基因。

1.8 統計學處理數據均通過SPSS 24.0進行統計學分析。利用χ2檢驗分析基質、免疫評分與臨床病理特征之間的相關性，采用t檢驗和Cytoscape軟件篩選差異表達基因，Kaplan-Meier方法評價肺腺癌TME中關鍵基因的預后價值。

2 結果

2.1 基質、免疫評分與肺腺癌臨床病理特征性分析501例肺腺癌患者的基質評分在-1 959.31~2 098.77，免疫評分分布于-1 355.85~2 905.30。如圖1A~D所示，除淋巴結轉移分期之外，免疫評分與T分期、M分期、臨床分期顯著相關（均P<0.05）。而基質評分與M期顯著相關（P<0.05）。肺腺癌患者根據評分分為高低兩組。如圖1E所示，在相同時間高免疫評分組總生存率較低免疫評分組更高（P=0.0093）。

圖1 基質、免疫評分與肺腺癌患者臨床病理特征和總生存率的相關性Fig 1 Association of stromal/immune scores with clinicopathological features and overall survival rate

2.2 基于免疫、基質評分的DEGs圖2顯示高免疫評分、基質評分組和低免疫評分、基質評分組之間表達水平有顯著差異的基因。與免疫低評分組相比，高評分組共出現257個基因表達上調，5個基因表達下調（表達差異倍數>2.0；P<0.01）。此外，與基質低評分組相比，基質高評分組中有392個基因表達上調，但沒有基因表達下調（表達差異倍數>2.0；P<0.01）。利用韋恩圖顯示免疫評分組和基質評分組共有74個共同的DEGs。

圖2 肺腺癌患者基于基質評分和免疫評分的基因表達熱圖和韋恩圖Fig 2 Heat maps and Venn diagrams of gene expression based on stromal score and immune score in lung adenocarcinoma

2.3 DEGs的功能富集分析基因本體論對基質評分差異表達基因的分析顯示與免疫反應有很強的相關性（表1）。生物過程（BP）分析主要富集于“補體激活”、“免疫反應調節”、“免疫反應”等。細胞成分（CC）分析主要包括“細胞外區域”、“細胞外泌體”、“細胞膜”等。分子作用（MF）分析包括“抗原結合”、“絲氨酸型內肽酶激活”等。

KEGG信號通路分析顯示，許多通路與免疫應答相關（表1），包括“ECM受體相互作用”、“PI3KAkt信號通路”、“細胞因子-細胞因子受體相互作用”等。同樣，在免疫評分差異表達基因中，BP分析主要富集在“免疫反應”、“炎癥反應”和“多肽或多糖的抗原處理和遞呈”等。CC分析主要包括“細胞膜”、“質膜的組成部分”、“MHCⅡ類蛋白質復合物”等。MF分析包括“受體激活”、“受體結合”、“跨膜信號受體激活”等。KEGG通路分析確定了與“金黃色葡萄球菌感染”、“吞噬體”和“同種異體排斥反應”相關的通路（表2）。

表1 基于基質評分的DEGs功能富集分析Tab1 Functional enrichment analysis of differentially expressed genes based on stromal scores（BPs，CCs and MFs）

表2 基于免疫評分的DEGs功能富集分析Tab 2 Functional enrichment analysis of differentially expressed genes based on immune scores（BPs，CCs and MFs）

2.4 構建PPI網絡和篩選關鍵基因圖3A顯示了基質評分的DEGs的PPI網絡，并顯示了網絡中排名前35位的差異基因。篩選出最值得關注的10個節點被認為是關鍵基因，包括COL1A2、COL4A2、COL3A1、COL1A1、COL4A1、COL5A1、THBS2、BGN、DCN和POSTN。同樣，圖3B給出了基于免疫評分的DEGs的PPI網絡，顯示出中排名前29位的基因表達蛋白。排在前10位的關鍵基因為ITGB2、GSF1R、CD86、SPI1、PLEK、TYROBP、LY86、ITGAM、HCK和CTSS。

圖3 基于基質、免疫評分差異表達基因和關鍵基因的PPI網絡Fig 3 PPI networks of differentially expressed genes and key genes based on stromal and immune scores

2.5 生存分析在20個基因中，共有4個DEGs顯示與OS時間顯著相關（圖4），PLEK、LY86、HCK高表達與較好的總生存率顯著相關（均P<0.05），POSTN被認為是一個預后不良相關基因（P<0.05）。這4個基因均為上調的DEGs基因。

圖4 篩選出的4個關鍵基因在肺腺癌患者中的生存分析Fig 4 Survival analysis of four key genes screened in patients with lung adenocarcinoma

3 討論

預測肺腺癌患者的預后仍然是研究人員和臨床醫生面臨的挑戰。惡性腫瘤細胞與TME的相互作用極大地影響了腫瘤的發展，進而影響了腫瘤的復發、耐藥和患者的總體、無進展生存率[12]。免疫細胞和基質細胞在腫瘤內的淋巴細胞浸潤已被證實與肺腺癌患者的預后有關[13]。隨著知識、技術，甚至臨床實踐標準的發展，分子表達譜在過去幾年中經歷了巨大的變化。檢測廣泛的分子表達水平對所有轉移性實體腫瘤患者都是必要的。因此，本研究嘗試從TCGA數據庫中篩選出影響肺腺癌患者預后的免疫、基質細胞相關基因。本研究創新點在于，這些基因與TME中的基質和免疫成分相關。這將有助于臨床工作者分析和預測患者的預后。

筆者通過ESTIMATE數據庫獲取肺腺癌患者基質細胞和免疫細胞的評分，探討該評分與肺腺癌患者的臨床病理特征和總生存期的相關性。結果顯示，隨著T分期、M分期和臨床分期的進展，患者的免疫評分隨之顯著降低，但與N分期無相關性。同時，M1期肺腺癌患者的基質評分相較M0期顯著下降，但與T分期、N分期和臨床分期無關。先前研究表明，晚期肺腺癌患者出現免疫細胞減少，包括B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、樹突狀細胞[14]。另一項研究發現，免疫評分和基質評分與肺腺癌患者的臨床特征，包括T期、M期、病理分期和總生存時間顯著相關[15]。有較多免疫細胞、基質細胞浸潤的肺腺癌患者分期較早，預后較好。此外，基于免疫、基質評分的生存分析也顯示出統計學差異。較低的基質、免疫評分與肺腺癌患者較差的總生存率相關。免疫細胞的存在起到了殺死腫瘤細胞和抑制腫瘤生長的作用，因此，從理論上講，免疫評分高的患者生存期應該會提高。筆者的研究與這一假設是一致的。

按基質細胞和免疫細胞的評分分為高分組和低分組，總共篩選了579個DEGs。隨后的GO分析發現它們大多參與免疫和炎癥反應及免疫反應調控、T細胞共刺激、抗原與受體結合。這證實了免疫系統在肺腺癌微環境形成中的重要作用。KEGG通路分析也顯示大部分的DEGs與免疫應答顯著相關，這與之前的報道一致。為了更好地理解DEGs之間的相互作用，筆者構建了PPI網絡。在由基質和免疫的差異基因構建的PPI網絡中，MCODE被用來選擇最重要的網絡模塊。本研究基于免疫評分確定了10個與免疫細胞相關的關鍵基因，基于基質評分確定了10個與基質成分相關的關鍵基因。在肺腺癌患者中篩選出4個TME相關基因，結合生存分析這4個基因的表達與總生存時間顯著相關。

普列克底物蛋白（PLEK）位于人類染色體2q14，在心血管疾病、牙周炎、潰瘍性結腸炎和類風濕性關節炎中顯著過表達，表明其在慢性炎癥性疾病中具有重要作用[16]。淋巴細胞抗原（LY86），又被稱為MD1、MD-1或MMD-1，敲除LY86導致單核細胞向MCP-1遷移減少，這可能是念珠菌易感性增加的基礎。LY86缺乏在結腸炎的進展中至關重要，因此LY86可能是未來炎癥性腸病介入治療的一個潛在靶點[17]。造血細胞激酶（HCK）編碼的蛋白是Src家族酪氨酸激酶的成員。它在中性粒細胞遷移和中性粒細胞脫粒中發揮作用。研究發現HCK的高表達與大腸癌患者的低生存率有關，并與活化的巨噬細胞具有相關性[18]。HCK活性的升高也在許多實體惡性腫瘤中被觀察到，包括乳腺癌和結腸癌，并與患者存活率降低相關。HCK的過度激活可能是由外周免疫細胞分泌的細胞因子刺激腫瘤細胞，從而增強腫瘤的活化，促進TME的形成。骨膜蛋白（POSTN）的過表達通過促進腫瘤的轉移和侵襲與胃癌轉移呈正相關[19]。轉移相關肺腺癌轉錄本1（MALAT1）通過負向調控miR-202-3p促進POSTN的表達，該生物傳導軸與宮頸癌細胞活力、遷移和侵襲以及上皮細胞向間充質轉化的調控密切相關[20]。在本研究中，POSTN被確定為與肺腺癌不良預后相關的基因。而在肺腺癌患者中，PLEK、LY86和HCK的高表達預示著較好的預后。這為闡明腫瘤發展的分子機制提供依據，也對預測患者預后具有重大意義。

在患者的預后預測和個體化治療時，分子遺傳特征與臨床病理特征相結合往往發揮重要作用[21]。免疫治療促進宿主免疫系統對腫瘤的識別，刺激免疫系統對腫瘤細胞生長增殖進行抑制[22]。與以往關注腫瘤細胞本身內在基因激活如何影響TME的報道相比，該研究更多關注于TME中的基因標志物，哪些基因會影響肺腺癌的進展，從而影響患者的預后。該研究為分析肺腺癌和其所在的TME之間復雜的相互作用提供新的思路。

這項研究也有一些局限性。首先，這是一項基于公開數據庫的回顧性研究，很難包涵不同地理人種間的差異。其次，考慮到不同腫瘤區域的微環境可能不同，在腫瘤的核心和侵襲邊緣進行免疫和基質評分也往往存在不同。最后，筆者的發現還需要進一步實驗驗證。