微小RNA-10a聯合甲胎蛋白、糖類抗原50、糖類抗原19-9檢測在結直腸腺癌早期診斷中的價值

趙 旭，仝 聰，李 毅，閻立昆

(陜西省人民醫院普外一科，陜西 西安 710068)

結直腸癌為消化系統常見惡性腫瘤，以腺癌居多。近年研究[1]發現，隨著我國人民生活方式及飲食習慣的改變，結直腸腺癌患病率呈逐年升高趨勢。結直腸腺癌預后與病理分期密切相關，流行病學調查[2]顯示，早期結直腸腺癌可治愈，5年生存率高達90%，晚期結直腸腺癌5年生存率不足10%，故及時診斷早期結直腸腺癌有其必要性。目前，診斷結直腸腺癌的金標準仍為病理學檢查，但該方法為有創性操作，不能作為篩查項目在臨床普及[3]。血清腫瘤標志物在近年惡性腫瘤篩查中發揮了重要作用，其中甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)、糖類抗原50(Carbohydrate antigen 50，CA50)、糖類抗原19-9(Carbohydrate antigen 19-9，CA199)等均與消化道惡性腫瘤發生和發展相關，但也缺乏足夠的靈敏度及特異度[4]。微小RNA(microRNA)是一種非編碼RNA，可調控細胞生長、增殖、分化及凋亡。microRNA-10a為microRNA家族中的一種，有研究[5]指出其在消化系統惡性腫瘤中高表達，且參與腫瘤的發生及發展。但目前microRNA-10a與消化系統惡性腫瘤的關系多集中于體外實驗，是否能作為早期結直腸腺癌的篩查指標則較少報道。基于此，本研究對早期結直腸腺癌患者和結直腸良性病變者的臨床資料進行比較，評估上述指標及其聯合檢測對早期結直腸腺癌的診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2017年1月至2020年1月我院收治的108例早期結直腸腺癌患者臨床資料(結直腸腺癌組)。病例納入標準：經病理學確診，且分期符合《中國早期結直腸癌及癌前病變篩查與診治共識意見》[6]制定的早期標準。排除標準：合并其他惡性腫瘤；既往有放化療等抗腫瘤治療史；伴免疫系統疾病、血液系統疾病或急慢性感染。經傾向性得分匹配法收集與結直腸腺癌組性別、年齡、病變部位1∶1匹配的108例結直腸良性病變者臨床資料(良性組)。良性組與結直腸腺癌組排除標準一致。

1.2 檢測方法 收集兩組患者入院次日清晨空腹靜脈血5 ml，經3000 r/min離心10 min，獲得血清樣本。向500 μl血清標本中加入等體積裂解液MZ(批號：161119、190128，德國QIAGEN公司)，經渦旋震蕩、靜置、離心、水相轉移等操作后，提取血清RNA，采用Nanodrop超微量分光光度計(美國Thermo Scientific公司)檢測230、260、280 nm處吸光度，在OD260/OD280為1.8～2.0且OD260/OD230>2.0時視為提取RNA成功，不符合要求者重新取樣檢測。采用基于莖-環引物的實時定量PCR(Stem-Loop RT-qPCR)法引入靶向特異性反轉錄物，引物序列為5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACCAC-

AAATT-3’，該反轉錄引物與成熟microRNA結合形成復合體，并向microRNA 5’末端延伸，獲得較長的反轉錄擴增子，接著行RT-PCR，正向引物序列為5’-TGCGGTACCCTGTAGATCCG-3’，反向引物序列為5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’，反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延伸32 s，共40個循環，最后72 ℃延伸10 min，溶解曲線分析溫度為60～95 ℃。采用相對法定量分析microRNA-10a表達水平，試劑由日本TAKARA BIO公司生產，儀器購自美國Bio- Rad公司。采用電化學發光法檢測血清AFP、CA50、CA199水平，試劑盒儀器均購自德國羅氏公司。

2 結 果

2.1 兩組患者一般資料比較 見表1。兩組患者性別、年齡、病變部位比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199水平比較 見表2。結直腸腺癌組血清microRNA-10a、 AFP、CA50、CA199水平顯著高于良性組(均P<0.05)。

表2 兩組患者血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199水平比較

2.3 血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199及其聯合檢測對早期結直腸腺癌診斷價值分析 見表3(圖1)。經ROC曲線分析，血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199對早期結直腸腺癌均有較高診斷價值，且四項聯合檢測診斷價值更高。

表3 血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199及其聯合檢測對早期結直腸腺癌診斷價值

圖1 血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199及其聯合檢測診斷早期結直腸腺癌ROC曲線

3 討 論

惡性腫瘤的早期發現對提升治愈率及生存率至關重要，腫瘤早期篩查工作也在臨床逐漸開展[7]。血清腫瘤標志物具有檢測簡便、普及度較高等優點，成為腫瘤早期篩查的主要檢測項目[8]。其中，AFP為肝臟合成分泌的糖蛋白，是原發性肝癌的公認標志物[9]。近年研究[10]也發現，AFP在頭頸部、消化道惡性腫瘤中高表達，對輔助診斷其他惡性腫瘤也有利。CA50也是一種廣譜腫瘤標志物，在糖基化酶被激活、細胞表面糖基結構改變時生成，可高表達于結直腸癌等消化道惡性腫瘤[11]。CA199為黏蛋白型糖類蛋白腫瘤標志物，對腺癌敏感，在胰腺癌、結直腸癌中均高表達[12]。本研究也發現，結直腸腺癌組血清AFP、CA50、CA199水平均顯著高于良性組，提示血清AFP、CA50、CA199對輔助診斷早期結直腸腺癌有利。不僅如此，血清AFP、CA50、CA199對早期結直腸腺癌均有較高診斷價值，其截斷值分別為6.74 ng/ml、23.80 U/ml、27.80 U/ml，也表明3項腫瘤標志物可用于早期結直腸腺癌的臨床篩查。需要注意的是，AFP、CA50、CA199檢測值還受檢測方法及試劑廠家等因素的影響，上述截斷值僅供臨床參考。此外，上述廣譜腫瘤標志物在篩查結直腸腺癌的靈敏度及特異度仍不高，還需與其他標志物聯合檢測，以提高診斷價值[13]。

microRNA為非編碼RNA，在RNA誘導沉默復合體的引導下可對靶mRNA進行降解或翻譯抑制，發揮對靶基因表達的調控作用，參與細胞生長、增殖、分化、凋亡等一系列生理病理過程，故microRNA表達水平的失常可誘發腫瘤等疾病[14]。Chen等[15]指出，異常表達的microRNA可經細胞周期、程序性細胞死亡、侵襲及血管生成等反應，調控腫瘤的發生、發展、轉移。因此，microRNA的表達水平在惡性腫瘤診斷、治療及預后判斷中的應用效果成為國內外學者研究的熱點[16-17]。microRNA-10a為近年發現的在原發性肝癌、膀胱癌等惡性腫瘤中表達異常的一種microRNA，可參與造血細胞分化及腫瘤細胞發生發展、免疫調節等生理病理過程[18]。Luo等[19]也指出，可能受作用基因位點或信號傳導途徑不同等因素影響，microRNA-10a在不同惡性腫瘤中表達水平不一，可作為多種惡性腫瘤篩查的敏感指標。研究[20]發現，microRNA-10a在急性髓樣白血病中高表達，但在慢性髓樣白血病中低表達，并通過調控粒細胞巨噬細胞集落刺激因子2的分泌加速細胞增殖。Yan等[21]研究發現，microRNA-10a在膀胱癌、胰腺癌中高表達，在食管癌、乳腺癌中低表達，因此microRNA-10a在各惡性腫瘤中發揮的效應不同。然而，低于microRNA-10a在結直腸癌中的表達水平，相關報道較少。對此，本研究發現，結直腸腺癌組血清microRNA-10a表達水平顯著高于良性組，且血清microRNA-10a對早期結直腸腺癌有較高診斷價值。這也說明，通過Stem-Loop RT-qPCR技術檢測血清microRNA-10a相對表達量能輔助篩查早期結直腸腺癌。然而，Stem-Loop RT-qPCR技術要求較高，且對提取的RNA質量有要求，基層醫療機構尚無此檢測項目，在臨床推廣及普及度方面不及上述廣譜腫瘤標志物，也是microRNA-10a作為篩查指標的缺陷[22-23]。本研究還發現，血清microRNA-10a與AFP、CA50、CA199聯合檢測對早期結直腸腺癌診斷價值更高，提示結直腸腺癌的發生、發展與多條信號通路相關，單一血清學檢測在判斷早期結直腸腺癌時仍然存在不足，應結合多項指標共同評估，以避免漏診，提高診斷準確率，盡可能地篩查出早期結直腸腺癌患者。Liu等[24]還發現，microRNA-10a表達量與惡性腫瘤惡性程度關系密切，其表達量與食管鱗狀細胞癌分化程度具有顯著相關性，對預測患者預后有利，故推測microRNA-10a表達量可能還與結直腸腺癌臨床特征有關。

綜上所述，血清microRNA-10a及腫瘤標志物AFP、CA50、CA199均能輔助臨床診斷早期結直腸腺癌，但四項聯合檢測診斷價值更高，有望納入直腸腺癌的常規篩查項目。但由于本研究為回顧性分析，收集資料有限，僅納入了早期結直腸腺癌患者，為評估microRNA-10a表達水平與結直腸腺癌分期、分化程度等臨床特征的關系，還需后續采用大樣本量進一步分析。