生物發(fā)光成像技術(shù)在腫瘤細胞活體可視化研究中的應(yīng)用研究進展

陳 丹，王文靜，王慶雅，曾 鋆，詹勇華

(西安電子科技大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院分子與神經(jīng)影像教育部工程研究中心，陜西 西安 710126)

1 生物發(fā)光成像技術(shù)在活體可視化研究中的應(yīng)用進展

生物發(fā)光成像技術(shù)(Bioluminescence Imaging，BLI)是一種可以在活體內(nèi)利用生物光信號關(guān)聯(lián)特定生理或病理細胞活動，實時跟蹤監(jiān)測細胞、蛋白質(zhì)甚至基因動態(tài)變化的分子成像技術(shù)。采用這種非侵入式技術(shù)可以在同一動物、同一空間和時間條件下定量細胞進程，檢測動物體內(nèi)生物大分子的動態(tài)變化[1]。

小動物活體BLI通常采用熒光素酶報告系統(tǒng)。將熒光素酶報告基因置于目標基因啟動子的控制之下，是構(gòu)建熒光素酶報告系統(tǒng)常采用的方法。利用組織特異性甚至活性嚴格依賴于某個特定蛋白的啟動子，可以在小動物體內(nèi)根據(jù)熒光素酶的表達情況追蹤某一細胞進程或跟蹤該特定蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。另一種方法是克隆熒光素酶基因的cDNA到靶基因位點上。與上述方法不同，這種方法可以做到可視化靶基因的表達，而不是其蛋白活性的變化。這兩種方法都可以實現(xiàn)活體內(nèi)生物學(xué)進程的實時無創(chuàng)成像。此外，成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)/CRISPR 相關(guān)蛋白(Cas)技術(shù)的出現(xiàn)為熒光素酶基因插入到目的基因位點提供了更簡便的方法。到目前為止，通過BLI進行細胞活動研究的小動物模型中，使用最多的是小鼠模型。近幾年，也開始出現(xiàn)斑馬魚模型的BLI研究報道。

螢火蟲熒光素酶在熒光素酶報告系統(tǒng)中應(yīng)用最為廣泛，它是一種熱不穩(wěn)定酶，半衰期約為2 h，可用于生物過程的動力學(xué)研究[2]。表達螢火蟲熒光素酶的器官和細胞攝入底物熒光素時，熒光素酶可以利用ATP作為能量來源，在氧氣存在的情況下催化熒光素發(fā)生氧化反應(yīng)形成氧化熒光素，同時發(fā)出生物熒光。而且，動物體本身不會產(chǎn)生熒光素，需要依靠外源攝入才能引起熒光素酶的催化反應(yīng)，所以熒光素酶報告系統(tǒng)在動物體內(nèi)沒有背景干擾，具有極佳的信噪比。在小鼠模型中，外源熒光素可以通過腹腔注射的方式進入體內(nèi)并迅速分布全身，甚至穿過包括胎盤在內(nèi)的血液組織屏障[2-3]。對于斑馬魚模型而言，熒光素通過腹腔注射或溶解在斑馬魚活動的水體中，都可以達到理想的效果[4]。除了螢火蟲熒光素酶外，還有許多其他熒光素酶也可以作為報告系統(tǒng)應(yīng)用于活體BLI。這些熒光素酶來源不同，催化底物也不盡相同，有D-熒光素、腔腸素和腔腸素類似物furimazine[2]。被麻醉的動物在吸收了外源熒光素酶底物后，放置在不透光的暗盒中，當(dāng)動物體內(nèi)熒光素酶催化底物并產(chǎn)生生物發(fā)光反應(yīng)時，安裝在暗盒中的電荷耦合設(shè)備成像系統(tǒng)(CCD)將捕捉熒光素酶反應(yīng)中產(chǎn)生的光信號，通過計算機采集圖像數(shù)據(jù)，分析軟件將電子信號轉(zhuǎn)換成數(shù)值，并最終形成圖像。最開始，大多數(shù)此類設(shè)備只可以生成二維圖像結(jié)果，直到三維漫射發(fā)光斷層成像(DLIT)設(shè)備被開發(fā)出來。DLIT設(shè)備考慮了光在組織中的散射和吸收，并可進行光源的3D位置和亮度的估算，從而獲得檢測動物的3D圖像結(jié)果[1-2]。

BLI技術(shù)的靈敏度受許多參數(shù)的影響，其中一個關(guān)鍵的影響因素是動物體內(nèi)熒光素酶標記細胞的深度。熒光素酶催化底物產(chǎn)生的光雖然具有較強的穿透能力，能夠穿透小型動物模型的組織，但是有研究發(fā)現(xiàn)每多1 cm的組織深度，光強就會降低10倍。Signore等[1]還發(fā)現(xiàn)小鼠體表毛皮上的色素沉著也會降低生物發(fā)光值，不過采用去除體表毛發(fā)或者選取白化小鼠品系的方式，可以減小這一誤差。而對于斑馬魚模型而言，由于其體型小而無毛，與其他動物相比更有利于體內(nèi)生物發(fā)光穿透組織到達皮膚表面。此外，BLI技術(shù)的靈敏度還受到調(diào)控?zé)晒馑孛副磉_的啟動子活性強度和細胞轉(zhuǎn)基因效率的影響。不僅如此，成像系統(tǒng)中所使用的CCD相機也是調(diào)節(jié)靈敏度的一個重要變量。

從倫理學(xué)角度來看，活體小動物BLI采用了非侵入式成像的方法，可以在不傷害和犧牲小動物的情況下達到實驗?zāi)康模O大程度上減少了所需實驗動物的數(shù)量。

2 BLI轉(zhuǎn)基因小鼠模型應(yīng)用進展

作為一種功能強大的無創(chuàng)分子影像技術(shù)，BLI技術(shù)可以在活體生理環(huán)境中監(jiān)測單個生物大分子的行為。在過去的十年里，這項技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)從對解剖結(jié)構(gòu)的靜態(tài)觀察擴展到對分子事件的動態(tài)分析。在腫瘤研究中，BLI與腫瘤模型相結(jié)合，為實時追蹤腫瘤進展相關(guān)的分子事件提供了新方法。利用BLI技術(shù)，可以在轉(zhuǎn)基因腫瘤小鼠模型中可視化腫瘤的生長和腫瘤相關(guān)的細胞活動，如腫瘤增殖、存活和侵襲以及細胞炎癥和免疫反應(yīng)。這些基于熒光素酶成像的轉(zhuǎn)基因小鼠模型(GEMM)不僅可以用于示蹤活體內(nèi)生理和病理過程，還可以檢測抗腫瘤化合物的治療效果。

2.1 顯示細胞生長的報告基因小鼠模型 細胞周期的異常往往會導(dǎo)致腫瘤的形成與發(fā)展，與細胞增殖調(diào)控有關(guān)的生物大分子的可視化動態(tài)分析無疑可以幫助大家更好地理解細胞生長過程中的各種活動。2012年Goeman等[5]報道了一個真核生物核因子(NF-Y)依賴性啟動子調(diào)控的熒光素酶報告基因GEMM，該模型中每個處于細胞周期中的細胞都會表達熒光素酶，結(jié)合BLI技術(shù)既可以觀察到小鼠體內(nèi)正常的細胞增殖區(qū)域，也可以觀察到肝損傷后細胞再生過程中NF-Y的活性。這項研究也表明此類小鼠模型可用于研究參與細胞增殖的基因功能和疾病發(fā)病機制中的異常增殖過程。它們也將有助于開發(fā)新的抗增殖和促增殖藥物，用于評估藥物在靶組織和非靶組織中的效果。此外，該研究團隊也已經(jīng)成功地將這一可跟蹤細胞增殖的小鼠模型運用于長期監(jiān)測小分子藥物在骨髓和脾臟細胞增殖過程中的效果[5-6]。

為了監(jiān)測細胞衰老和惡性轉(zhuǎn)化的早期階段，由p16INK4a蛋白編碼基因和熒光素酶報告基因組成的多種轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)被構(gòu)建出來[7-9]。p16INK4a屬于細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶的抑制蛋白，對細胞周期蛋白復(fù)合物的活性起負調(diào)控作用。除此之外，p16INK4a還可促進細胞衰老以應(yīng)對諸如癌基因激活這樣的應(yīng)激情況。最早相關(guān)的報道是構(gòu)建了一種表達人類完整的p16Ink4a和熒光素酶融合蛋白的GEMM[7]。隨后，Baker等[8]構(gòu)建了由2617 bp的p16INK4a蛋白編碼基因啟動子片段調(diào)控的熒光素酶報告基因GEMM。之后又將熒光素酶基因靶向敲入到內(nèi)源性p16INK4a蛋白翻譯的起始位點，使熒光素酶基因位于p16INK4a蛋白編碼基因的開放閱讀框內(nèi)，并且保留了已知的順式調(diào)節(jié)元件[9]。以上三個轉(zhuǎn)基因報告系統(tǒng)都能夠監(jiān)測衰老和腫瘤發(fā)生的早期階段。此外，熒光素酶基因敲入p16INK4a的GEMM還被用來研究環(huán)境因素對衰老的影響[10]。

2007年Ohtani等[11]建立了由p21蛋白編碼基因部分啟動子片段調(diào)控的熒光素酶報告基因GEMM，用來檢測基因毒性應(yīng)激下細胞周期在時間和空間上的變化。在此之后，Tinkum和Mcmahon等[12-13]采用基因敲入技術(shù)，將熒光素酶置于內(nèi)源性p21蛋白編碼基因啟動子的控制之下，從而構(gòu)建了GEMM。Tinkum等[12]還通過p53基因缺陷小鼠與該GEMM進行雜交，證實p53是p21蛋白編碼基因的啟動子誘導(dǎo)熒光表達所必需的。事實上，這兩組研究表明外源性和內(nèi)源性p21蛋白編碼基因的啟動子都受到p53的調(diào)控[11-12]，這使得這兩種模型不僅能在體內(nèi)監(jiān)測p21Cip1活性，也能監(jiān)測p53的激活。

p53蛋白是細胞應(yīng)激時中止細胞周期進程的關(guān)鍵因子。利用p53依賴性的mdm2和Puma啟動子調(diào)控?zé)晒馑孛富颍梢詷?gòu)建兩種用于監(jiān)測p53轉(zhuǎn)錄活性的報告基因GEMMs[14-15]。鑒于p53在正常細胞和細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中都有著重要作用，p53報告基因GEMM也將成為幫助藥物研發(fā)領(lǐng)域研究者們預(yù)測、追蹤和表征藥物不良反應(yīng)的有力工具。

2.2 示蹤腫瘤相關(guān)炎癥和免疫反應(yīng)的小鼠模型 2002年，Carlsen等將核因子-κB(NF-κB)反應(yīng)元件插入到熒光素酶基因的上游調(diào)控區(qū)域并建立了GEMM。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子在眾多生理和病理過程的炎癥反應(yīng)中都起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[2，16]，這使得由NF-κB反應(yīng)元件誘導(dǎo)的熒光素酶報告基因GEMM可以作為示蹤活體內(nèi)炎癥反應(yīng)的理想工具。利用這一模型可以實現(xiàn)體內(nèi)很多組織促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)的成像研究，如胰島B細胞和心臟移植、心肌梗死、大腸桿菌性乳腺炎等[2]。最近，有報道構(gòu)建過表達腫瘤壞死因子(TNF-α)和由NF-κB反應(yīng)元件驅(qū)動熒光素酶的GEMM[17]，生物發(fā)光成像顯示過表達TNF-α可有效激活小鼠模型中NF-κB熒光素酶表達，從而為篩選靶向TNF-α/NF-κB信號通路來治療炎癥和多種自身免疫疾病的潛在藥物提供評估工具。早在2006年，Ishikawa等[18]將熒光素酶基因敲入內(nèi)源性環(huán)氧合酶2編碼基因的起始位點，構(gòu)建了兩種GEMM來監(jiān)測慢性和急性炎癥反應(yīng)。除此之外，也有學(xué)者利用其它參與炎癥反應(yīng)相關(guān)過程的基因，用它們的啟動子驅(qū)動熒光素酶報告基因并構(gòu)建GEMM，如Smad3/4依賴性啟動子、人IL-1β、CXCL8、nestin和NFκb2。2015年，Hayashi等[19]將熒光素酶基因整合到帶有人白細胞介素6基因序列的細菌人工染色體上，構(gòu)建了一種可以敏感地監(jiān)測炎癥反應(yīng)的GEMM。但是上述這些GEMM都是用于監(jiān)測全身各種健康或受損組織中的炎癥反應(yīng)，未能在腫瘤相關(guān)炎癥研究中發(fā)揮作用。

關(guān)于可視化腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)的研究相對較少。Rauch等[20]選擇了兩種GEMM的雜交后代作為實驗?zāi)Ｐ蛠硌芯孔园l(fā)性淋巴瘤。兩種GEMM雜交的后代小鼠可自發(fā)產(chǎn)生白血病和淋巴瘤，利用BLI可追蹤其體內(nèi)細胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的炎癥反應(yīng)信號，有助于研究與腫瘤發(fā)生有關(guān)的炎癥步驟。利用這一模型，該研究團隊還證實了炎癥刺激可以引發(fā)淋巴腫瘤[21]。

盡管富有挑戰(zhàn)性，科學(xué)家們也依然在不斷努力嘗試構(gòu)建各種可視化GEMM來觀察體內(nèi)免疫反應(yīng)的相關(guān)過程。2018年，Szyska等[22]選擇活化T細胞核因子(NFAT)編碼基因啟動子調(diào)控的螢火蟲熒光素酶基因以及組成性啟動子調(diào)控的海腎熒光素酶基因構(gòu)建了雙報告基因GEMM。該模型可以用來監(jiān)測腫瘤引起的T細胞激活，并進行相關(guān)的動態(tài)分析。利用叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子P3(Foxp3)蛋白編碼基因的啟動子控制熒光素酶和白喉毒素受體基因，從而構(gòu)建的GEMM也是一種免疫反應(yīng)的可視化模型[23]。還有一種用于免疫反應(yīng)的可視化GEMM，是利用人T細胞表面抗原CD4編碼基因連接熒光素酶報告基因構(gòu)建而成的[24]，也可以作為研究腫瘤免疫學(xué)的有力工具。

3 腫瘤細胞活體可視化研究進展

基因工程小鼠腫瘤模型是研究腫瘤發(fā)生相關(guān)分子機制的有力工具。結(jié)合非侵入性的BLI技術(shù)，攜帶生物成像報告系統(tǒng)和人類腫瘤的GEMM可以用來觀察特定的腫瘤細胞進程和被標記的分子事件，為腫瘤早期檢測以及認識腫瘤起源、免疫系統(tǒng)作用、腫瘤血管生成、腫瘤侵襲和腫瘤治療等相關(guān)研究提供幫助。近年來，許多研究利用BLI技術(shù)監(jiān)測GEMM體內(nèi)腫瘤的生長。這些GEMM能夠模擬高死亡率腫瘤進程，包括腦癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和肝癌等[2，25]。

2002年，Vooijs等[25]首次構(gòu)建了腫瘤發(fā)光小鼠模型，用來研究腦垂體腫瘤的發(fā)生。他們利用攜帶條件突變型Rb蛋白等位基因的小鼠和在垂體特異性啟動子驅(qū)動下表達Cre重組酶和熒光素酶的小鼠雜交。雜交后代小鼠產(chǎn)生的垂體腫瘤攜帶熒光標記，有助于開發(fā)靶向Rb通路的防癌抗癌藥物。隨后，又有研究團隊利用調(diào)控細胞周期和凋亡的相關(guān)轉(zhuǎn)錄激活因子E2F1的啟動子-熒光素酶轉(zhuǎn)基因(Ef-Luc)小鼠與人膠質(zhì)瘤GEMM雜交，建立少突膠質(zhì)細胞瘤模型，通過BLI技術(shù)實時觀察少突膠質(zhì)細胞瘤的發(fā)展[26]。

采用前列腺特異性啟動子構(gòu)建的熒光素酶GEMM可以用來監(jiān)測前列腺惡性腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。2006年，Lyons等在誘導(dǎo)形成的小鼠前列腺增生和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移模型的基礎(chǔ)上，利用前列腺上皮細胞特異性表達的抗原(PSA)編碼基因的啟動子調(diào)控?zé)晒馑孛富虮磉_，實現(xiàn)了長期追蹤雄激素阻斷對前列腺腫瘤生長的影響[27]。同年，Seethammagari等[28]利用PSA啟動子調(diào)控?zé)晒馑孛笜?gòu)建了可以用來監(jiān)測前列腺腫瘤發(fā)光以及腫瘤轉(zhuǎn)移的GEMM。2017年，有報道將共表達表觀遺傳調(diào)控因子的核心成分(EZH2)蛋白-熒光素酶小鼠與攜帶Probasin-Cre系統(tǒng)的小鼠雜交，獲得EZH2蛋白與熒光素酶在前列腺特異性表達的GEMM，可長期監(jiān)測前列腺腫瘤的生長和潛在轉(zhuǎn)移[29]。

熒光素酶GEMM也為肝臟和淋巴腫瘤研究提供了新方法。2011年，Lu等[30]利用內(nèi)源性甲胎蛋白(AFP)啟動子驅(qū)動胸腺嘧啶激酶和熒光素酶報告基因，構(gòu)建了基因敲入小鼠。同年，Park等[31]也報道了一種利用AFP啟動子調(diào)控?zé)晒馑孛副磉_的轉(zhuǎn)基因小鼠。這兩種小鼠模型都可以通過BLI技術(shù)監(jiān)測化學(xué)誘導(dǎo)產(chǎn)生的肝癌[30-31]。還有研究者采用Cre重組酶介導(dǎo)的基因敲除技術(shù)構(gòu)建特殊的熒光素酶小鼠模型，其肝臟腫瘤中可檢測到生物發(fā)光信號[32]。通過BLI技術(shù)，也可實現(xiàn)胰腺T細胞腫瘤和B細胞淋巴瘤的無創(chuàng)監(jiān)測，觀測位于淋巴結(jié)和肝的腫瘤轉(zhuǎn)移[33-34]。

在胰管腺癌(PDAC)的基因研究和病理研究中同樣使用到了熒光素酶標記的GEMM。Manni和他的研究團隊構(gòu)建了兩種小鼠模型，其中熒光素酶報告基因會在增殖細胞中表達，從而實現(xiàn)在活體內(nèi)可視化PDAC的增殖過程，為長期跟蹤PDAC的發(fā)生和發(fā)展提供了直觀的可視化的研究方法[35]。

為了可視化追蹤活體腫瘤中小分子化合物，2014年Zhong等[36]利用他莫昔芬誘導(dǎo)Cre重組酶系統(tǒng)，構(gòu)建了在上皮細胞中致癌基因和熒光素酶基因共表達的口腔腫瘤小鼠模型，可用于監(jiān)測口腔腫瘤的發(fā)展，模擬臨床上小分子和圖像引導(dǎo)放射治療的反應(yīng)。

在乳腺癌可視化和活體監(jiān)測研究中，BLI技術(shù)也應(yīng)用廣泛。2012年，有報道利用MMTV啟動子調(diào)控?zé)晒馑孛负投嗔霾《局行蚑抗原在乳腺中表達并構(gòu)建GEMM，實現(xiàn)了乳腺腫瘤進程的可視化研究[37]。Δ16HER2基因是人表皮生長因子受體2(HER-2)編碼基因的剪接變異體，在小鼠模型中采用MMTV啟動子調(diào)控?zé)晒馑孛负挺?6HER2基因的表達，可監(jiān)測活體內(nèi)Δ16HER2基因介導(dǎo)的乳腺腫瘤的發(fā)生，探索Δ16HER2的功能[38]。此外，也有研究團隊利用實體腫瘤往往形成乏氧微環(huán)境的特點，開發(fā)出能夠?qū)Ψρ鯀^(qū)域進行響應(yīng)成像的GEMM。隨后，利用這一小鼠模型與乳腺腫瘤轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，實現(xiàn)在數(shù)周內(nèi)對腫瘤的生長進行縱向跟蹤，評價藥物治療的效果[39]。與之同時，Jia等[40]報道了一種可監(jiān)測乳腺腫瘤早期發(fā)生過程中人源端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)編碼基因表達水平的熒光素酶GEMM。早在2003年，《Nature Medicine》上開創(chuàng)性地報道了使用未產(chǎn)生性激素的幼鼠和去除卵巢的成年小鼠構(gòu)建的熒光素酶GEMM，該模型中熒光素酶報告基因的表達受到雌激素受體反應(yīng)元件的調(diào)控，可用于觀測雌激素受體活性在乳腺癌惡性轉(zhuǎn)化過程中的動態(tài)變化[3]。2016年，Vantaggiato等[41]利用上述小鼠模型誘導(dǎo)散發(fā)性乳腺癌，結(jié)合BLI技術(shù)從腫瘤早期階段到觸診階段對雌激素受體的活性進行成像追蹤。

如今，一些融合型GEMM也被應(yīng)用于BLI成像，如Vegfr3小鼠模型，這一類小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)入了內(nèi)源性血管內(nèi)皮生長因子受體3(VEGFR3)基因啟動子調(diào)控的EGFP-熒光素酶融合蛋白，誘發(fā)該小鼠形成乳頭狀瘤，便可跟蹤監(jiān)測乳突淋瘤誘導(dǎo)淋巴管的生成。此外，荷蘭的研究團隊為了通過BLI技術(shù)觀測自發(fā)形成的腫瘤負荷，構(gòu)建了一種廣泛表達的條件性熒光素酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型，隨后利用該小鼠與在肺上皮細胞中表達條件性致癌基因并可誘發(fā)非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，最終實現(xiàn)了無創(chuàng)示蹤活體內(nèi)肺癌的發(fā)生發(fā)展過程[2]。

4 斑馬魚模型在基因表達實時成像研究中的應(yīng)用進展

人們發(fā)現(xiàn)盡管人類和斑馬魚的進化分歧發(fā)生在4.5億年前，但兩者在控制信號傳導(dǎo)、增殖、分化、凋亡等相關(guān)分子信號通路上仍然高度保守。因此，在細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)實驗和人類臨床試驗之間，也有研究采用斑馬魚模型來探索惡性疾病的治療效果。因斑馬魚胚胎具有光學(xué)透明的特性，常用綠色熒光蛋白標記并在其整個胚胎中分析缺陷或病理表型，研究疾病的發(fā)展過程[2]。而等到斑馬魚成年后，會逐漸失去這一特性，從內(nèi)部器官發(fā)出的熒光信號會在穿透表皮時被削弱，影響觀察，使得在成年斑馬魚中檢測熒光蛋白變得比較困難。如果采用BLI技術(shù)，由于不需要外部光源，背景噪聲信號弱，熒光素酶反應(yīng)的發(fā)射光波長也足以穿透成年斑馬魚的所有組織，則可以克服這一困難。

不過與小鼠模型相比，利用BLI技術(shù)構(gòu)建的熒光素酶轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型依然很少。2013年，Chen等[4]首次實現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因斑馬魚的體內(nèi)生物發(fā)光成像，其構(gòu)建的心肌細胞分化因子(cmlc2)啟動子調(diào)控的熒光素酶斑馬魚轉(zhuǎn)基因模型還可以用來估測內(nèi)臟和心臟中的肌肉量，縱向追蹤損傷后的心臟再生。還有研究在泛素啟動子調(diào)控?zé)晒馑孛溉沓上竦陌唏R魚轉(zhuǎn)基因模型中提取帶Luc標記的成年斑馬魚造血干細胞，再將其移植到普通斑馬魚品系中。隨后，通過BLI技術(shù)非侵入性地跟蹤斑馬魚中移植的造血干細胞，觀察其植入和歸巢過程，從而篩選增強細胞歸巢能力的小分子化合物[42]。此外，利用NF-κB啟動子片段驅(qū)動熒光素酶和GFP蛋白編碼基因，構(gòu)建雙向報告基因斑馬魚模型，可以實現(xiàn)體內(nèi)外NF-κB轉(zhuǎn)錄因子表達變化的實時監(jiān)測[2]。目前，BLI技術(shù)主要還是應(yīng)用于斑馬魚異種移植瘤模型中，通過用熒光素酶標記的癌細胞來跟蹤體內(nèi)腫瘤的生長，評估抗腫瘤和抗血管生成化合物的療效[43]。

5 熒光素酶成像缺點

如前所述，BLI在臨床前研究應(yīng)用中具備許多優(yōu)勢，但是在分析成像結(jié)果上該技術(shù)仍存在一定局限性。首先，BLI只能進行半定量研究，無法做到絕對定量，難以規(guī)范化和標準化。生物發(fā)光信號值也并不完全與細胞數(shù)量成正比，熒光素酶與底物反應(yīng)的各個步驟都可能受到內(nèi)源性和外源性因素的影響，導(dǎo)致誤差的產(chǎn)生，甚至在不同的細胞或組織內(nèi)熒光素酶、熒光素以及ATP等輔助因子的數(shù)量都存在著差異[44]。其次，不同種熒光素酶的半衰期和穩(wěn)定性介于幾小時至幾天之間，使用分泌型熒光素酶時，血液和尿液的某些循環(huán)成分也會影響到酶的穩(wěn)定性[45]。再加上動物體內(nèi)表達熒光素酶細胞的深度和位置都會影響B(tài)LI信號的采集，導(dǎo)致目前BLI技術(shù)的應(yīng)用僅僅局限于小型動物。此外，底物的給藥途徑也是影響B(tài)LI成像效果的關(guān)鍵因素之一。研究發(fā)現(xiàn)靜脈和腹腔注射后底物在動物體內(nèi)的生物分布狀態(tài)不同，靜脈注射使底物在組織間分布更均勻，而腹腔注射則可延長器官攝取底物的時間[46]。

在動物體內(nèi)，熒光信號的淬滅是由色素分子(如血紅蛋白)介導(dǎo)的，并且與信號源的深度有關(guān)。動物的毛發(fā)和皮膚也會分散和衰減熒光信號，尤其是黑色皮毛。實驗證實與白鼠相比，黑鼠發(fā)射出的熒光信號更低[47]。還有一點，雖然BLI技術(shù)由于動物熒光背景低而具有高靈敏度，但有的底物，如腔腸素，在不存在酶的情況下其自生發(fā)出的光又會增加熒光背景[2]。

6 結(jié) 語

腫瘤作為一種全身性的疾病，早在一個多世紀以前就已經(jīng)被人類關(guān)注，并開展了廣泛的研究。近十年來，對于腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中宿主體內(nèi)大環(huán)境的調(diào)控機制逐漸受到眾多學(xué)者的重視。例如，一些新出現(xiàn)的證據(jù)強調(diào)了腫瘤進展過程中宿主體內(nèi)造血功能的時空激活和免疫反應(yīng)[48-49]。事實上，腫瘤組織和淋巴通路之間也有著極其復(fù)雜的相互作用。在管腔乳腺癌(LBC)細胞存在下的體內(nèi)環(huán)境會促進一些原本為惰性的腫瘤細胞彌散性生長。LBC還會分泌激活骨髓間充質(zhì)細胞(BMC)的細胞因子，由此產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)進一步促進了腺癌的生長，而使用阿司匹林等抗炎化合物可以抑制BMC的激活，阻斷該級聯(lián)反應(yīng)。這些研究說明宿主體內(nèi)系統(tǒng)大環(huán)境在腫瘤進展中起重要作用[49]。然而，系統(tǒng)大環(huán)境與腫瘤組織靶點之間通路的作用方式尚未被闡明，仍有一些重要的問題亟待解答，對這一方面的研究也需要建立一系列可以實時跟蹤腫瘤進展的相關(guān)模型。

BLI技術(shù)與報告基因動物模型的出現(xiàn)徹底改變了包括腫瘤在內(nèi)的生物進程的研究方式。通過活體無創(chuàng)監(jiān)測生物發(fā)光信號，可以在目標器官上或是整個動物體內(nèi)實現(xiàn)生物大分子的可視化研究，實時顯示分子事件。該模型的非侵入性成像，可以幫助追蹤單個實驗動物體從胚胎到成年的生理進程事件，并進行腫瘤進展和藥物反應(yīng)的縱向研究，從而大大減少了每個實驗環(huán)節(jié)所需的動物數(shù)量。BLI技術(shù)與報告基因動物模型也可以呈現(xiàn)出由于個體之間的差異而導(dǎo)致的實驗結(jié)果變化。迄今為止，BLI技術(shù)與報告基因動物模型已經(jīng)在腫瘤基礎(chǔ)和應(yīng)用研究領(lǐng)域取得了重要成果，相信在未來它們將能夠更廣泛地應(yīng)用于腫瘤轉(zhuǎn)化、藥物開發(fā)和毒理學(xué)等研究和應(yīng)用領(lǐng)域。