大鼠功能性下頜前伸后髁突軟骨骨化前后PLC-γ1的變化研究

盛?，摚跚镤J，尉 靜，關秀娟，趙利霞，左艷萍*

(1.北京市通州區新華醫院口腔正畸科，北京 101100；2.河北醫科大學第一醫院口腔正畸科，河北 石家莊 050031)

功能性下頜前伸后髁突后部軟骨細胞增殖，但軟骨細胞向骨細胞轉化的機制尚不明確。已證實下頜骨髁狀突骨改建受多種內源性調節因子的影響，包括骨形態發生蛋白、X型膠原Sox-9、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、核因子κB 受體活化因子配基、基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotein,MMP) -2 、MMP-9、牙本質基質蛋白1、整合素β等[1-3]。這些調控因子并不是獨立存在的，而是與組織細胞內許多相關因子聯合發揮作用，其中血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)是細胞膜上的大分子跨膜蛋白，能接收外界信號，其下游的信號因子磷脂酶C-γ1(phospholipase C-γ1，PLC-γ1)在腫瘤細胞、卵母細胞、牙周膜細胞等細胞的分裂增殖信號轉導過程中發揮著關鍵作用,因此，PLC-γ1在許多疾病臨床治療中成為重要靶點[4-8]。那么PLC-γ1是否對軟骨細胞分裂、增殖有調控作用呢？其在下頜功能性前伸后髁突軟骨骨化過程中扮演了一個什么角色？本研究采用免疫組織化學染色方法檢測PLC-γ1在大鼠功能性下頜前伸前后髁突軟骨后部表達水平的變化，探討 PLC-γ1在功能性下頜前伸后大鼠髁突后部軟骨骨化過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗設計 60只4周齡健康雄性SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠(河北醫科大學動物實驗中心提供)，平均體重90 g。于河北醫科大學第一醫院中心實驗室(室溫約26 ℃)適應性飼養1周后，將大鼠隨機等量分為2組，實驗組大鼠24 h/d佩戴自制斜面導板矯治器，對照組不作任何處理。于實驗第1、3、7、14、21、28 天時2組采用斷頸法各處死5只。

1.2組織處理 大鼠處死后，盡快取出雙側整塊顳下頜關節，注意避免損傷關節囊。4%多聚甲醛 (0.1 mol/L PBS，pH 7.0～7.6，含0.1%焦磷酸二乙酯)固定24 h，10%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)室溫脫鈣2周(用大頭針針刺組織無阻力進入表示脫鈣成功)，乙醇梯度脫水，常規石蠟包埋，包埋時盡量保證髁突矢狀面與蠟塊表面平行。髁突縱向切片，厚度約5 μm，將組織切片附于經多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60 ℃過夜。

1.2.1HE染色 切片常規二甲苯脫蠟，梯度酒精下行水化，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分化數秒，1/500氨水中返藍，0.5%伊紅染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.2免疫組織化學分析 切片常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇置換二甲苯，1%甲醇過氧化氫消除內源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽抗原修復液進行抗原修復，滴加正常山羊血清封閉液,室溫20 min。棄去多余液體,不洗。滴加一抗 (anti-PhosPho-PLC-γ1，兔多抗，assay公司，美國)，4 ℃過夜。按免疫組織化學試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)要求滴加生物素化第二抗體(IgG)， 37 ℃ 20 min。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃ 20 min，PBS沖洗。3,3′-二氨基聯苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木素復染細胞核?？瞻讓φ眨篜BS代替一抗。

1.3圖像分析 應用光學顯微鏡(BX51TPHD-J11，奧林巴斯公司，日本)多功能真彩色細胞圖像分析管理系統采集40倍及400倍HE染色切片圖像，對髁突軟骨后部免疫組織化學染色切片，隨機選擇3個視野，采集400倍圖像，統計陽性細胞數和著色強度，取平均值，結果用強度-色調-飽和度(intensity-hue-saturation，IHS)值表示，計算公式為IHS=A×B。其中A表示陽性細胞數，取值范圍：0為0%，1為1%～10%,2為11%～50%，3為51%～80%，4為81%～100%；B表示著色強度，0為陰性，1為弱陽性，2為陽性，3為強陽性。

1.4統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件分析數據。計量資料組間比較采用獨立樣本的t檢驗，時點間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1HE染色結果 髁突軟骨厚度由后向前逐漸變薄，從軟骨表面向內部分為5層，分別是表面纖維層、增殖層、過渡層、肥大層、鈣化軟骨層，各層細胞形態特征不同，層帶之間相互延續，軟骨下方為骨小梁，與軟骨的鈣化軟骨層相延續(圖1，2)。

2.2免疫組織化學染色結果 細胞質內PLC-γ1表現為陽性著色，DAB顯色棕黃色，著色水平明顯高于背景水平，主要表達于髁突軟骨的增殖層和過渡層。實驗組第14天時表達最強(圖3～6)。 空白對照組：PBS代替一抗組細胞質未見陽性著色顆粒(圖7)。

2.3IHS值統計結果 第7、14、21、28 天時實驗組髁突軟骨后部PLC-γ1表達的IHS值高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；2組不同時間點PLC-γ1表達的IHS值差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組大鼠髁突軟骨后部PLC-γ1表達情況(IHS值)比較Table 1 The PLC-γ1 expression(IHS value) in the posterior condylar cartilage between two groups

Figure 2 The morphological characteristics of condyle cartilage of rats (×400)

3 討 論

本研究HE染色結果顯示，髁突軟骨后部增厚明顯，由后向前髁突軟骨厚度逐漸變薄，提示髁突后部發生了較為明顯的骨改建，與前人實驗研究結果一致[9-10]，因此選擇髁突軟骨后部進行免疫組織化學染色研究。

目前研究發現，PLC-γ1上游信號因子之一是VEGF及其受體VEGFR-2，早期研究發現VEGF是一種內皮系統組織細胞的特異性因子，在動物胚胎期血管發生過程中起著重要作用[11]?，F研究證實，非內皮系統組織中也廣泛存在VEGF，VEGF與骨形成蛋白具有相似的功能，在軟骨成骨過程中協調著軟骨細胞增殖與骨形成之間的關系，在軟骨細胞轉換為骨細胞的過程中起著重要作用[12-14]。研究發現，VEGF在小鼠軟骨骨化的早期和晚期都發揮了重要作用，將小鼠VEGF基因敲除后其軟骨骨化過程受阻[15]。近年來研究發現，VEGF及其受體VEGFR-2在髁突軟骨的骨改建過程中同樣發揮著不可或缺的作，有學者在大鼠髁突和顳骨關節窩中檢測到了VEGF，提出骨取代軟骨的標志是軟骨細胞表達VEGF刺激新生血管形成，VEGF是連接血管和新骨形成的重要因子[16]。將生長發育期SD大鼠采用功能矯治器導致下頜前伸后可刺激髁突軟骨發生適應性改建，增強軟骨細胞的增殖活性，使其分化加速，VEGFR-2作為 VEGF 的特異性受體，介導了 VEGF生物學作用，參與了大鼠髁突軟骨的骨改建[17]。髁突軟骨細胞分泌VEGF有的通過自分泌方式，有的通過旁分泌方式，VEGF與其受體VEGFR-2作用誘導軟骨細胞肥大層內的血管化進程，促進軟骨骨化[18]。

哺乳動物體內廣泛存在PLC-γ1，其一般位于細胞質內，當細胞處于靜止狀態時PLC-γ1通常維持在一定水平，而當機體組織接收到外界刺激，例如細胞內的大分子調控因子VEGF將外界刺激信號進一步傳遞到細胞內，接收到上一級信號刺激后，PLC-γ1的酪氨酸磷酸化位點被激活，從而促進組織細胞的分裂、增殖、分化等過程[14，19]。其具體過程如下：VEGF接收到外界信號刺激后，進一步作用于細胞膜上的受體VEGFR-2，將細胞膜上受體蛋白的酪氨酸殘基激活，而這些受體又具有酪氨酸激酶活性，當PLC-γ1 與活化的生長因子受體結合后，受體本身的蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)發生自動磷酸化后被激活，與胞內PLC-γ1的SH2、SH3結構域結合并將其酪氨酸殘基激活，從而進一步激活細胞內一系列下游信號傳導通路。PLC-γ1的SH2與PTK結合后，作用于細胞膜上的磷脂酰肌醇4，5二磷酸并將其分解為二酰甘油(diacylglycerol,DAG)和1,4,5-三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)。DAG可激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，IP3可引起細胞內鈣庫釋放鈣離子，最終完成細胞內信號的傳遞，引發細胞的增殖與分化[20]。VEGFR2是VEGF的主要功能受體,已有5個主要的磷酸化位點被證實，其中Tyr-1175、Tyr-801是PLC-γ1結合位點[21]。PLC-γ1-Tyr783的磷酸化激活PLC-γ1的活性，在調控血管內皮細胞促進血管新生方面發揮了重要作用。胚胎期動脈血管的發生即通過VEGFR2的Tyr-1175被激活后,進一步激活胞內的PLC-γ1來完成[22]。Husain等[23]研究發現，VEGFR-2能夠通過PLC-γ1 信號的活化促進內皮細胞的增殖效應。

VEGF-VEGFR-2-PLC-γ1信號鏈在血管生成過程中發揮了重要作用,那么該信號鏈是否在下頜髁突前伸后軟骨骨化過程中同樣發揮作用？本研究結果顯示，第7、14、21、28 天時實驗組髁突軟骨后部PLC-γ1表達的IHS值高于對照組，與前人關于VEGF及其受體VEGFR-2在大鼠功能性下頜前伸后髁突軟骨后部的表達變化規律具有一致性[24]。已經證實VEGF在大鼠下頜功能前伸后髁突軟骨后部軟骨成骨過程中發揮了一定作用[25]，因此，推測VEGF-VEGFR-2-PLC-γ1這條信號通路在功能性下頜前伸大鼠髁突軟骨骨化過程中發揮了一定作用。

下頜功能前伸后髁突軟骨改建是個復雜的過程，PLC-γ1和VEGF在軟骨骨化過程中具體機制尚未明確，本研究僅通過PLC-γ1的表達情況與前人關于VEGF及其受體VEGFR-2的表達具有一致性來推測該信號鏈在大鼠下頜功能前伸后髁突軟骨骨化過程中發揮作用尚不全面，這是本研究的不足之處，如引入PLC-γ1及VEGF的抑制劑從對立面進一步證實則可信度更高。但可以肯定的是PLC-γ1是眾多細胞因子信號途徑的交匯，在組織反應的信號轉導過程中是一個關鍵節點，PLC-γ1可能參與了下頜功能性前伸大鼠髁突軟骨骨化的過程，對其水平進行檢測對髁突部軟骨骨化的研究具有重要參考價值，相信其在口腔領域也將會為功能矯治骨骼改建靶點選擇提供參考。