實時熒光定量聚合酶鏈反應技術在腎結核病理診斷中的應用價值

范正超，尹 航，劉建震，李崇斌

(河北省胸科醫院泌尿外科，河北 石家莊 050000)

泌尿生殖系結核是僅次于淋巴結核病的第二大肺外結核病，其中腎結核最為多見[1-2]。病原學檢查及病理學檢查是確診腎結核的重要手段，但不典型的病理形態學表現經常與其他慢性肉芽腫疾病如非結核分枝桿菌感、真菌感染、血管炎、結節病等難以區分，故病原學檢查有著更重要的意義[3-4]，臨床和病理科都應盡力尋找病原菌證據。病理組織標本結核分枝桿菌病原菌的檢測方法包括組織培養、抗酸染色、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)及宏基因測序等分子生物學技術。結核分枝桿菌培養是結核病診斷的金標準，但因培養時間較長，臨床應用價值受限[5]。抗酸染色被認為是診斷結核病的重要參考指標，但病理組織抗酸染色的敏感度并不理想，低于結核分枝桿菌培養檢查結果，且抗酸染色陽性時不能排除非結核分枝桿菌、麻風桿菌、軍團菌屬等抗酸染色陽性菌[6-7]。近年來，各種病原學檢查技術尤其是分子生物學檢查方法應用于病理標本的檢查，明顯提高了結核病尤其是肺外結核病的確診率[8]。本研究應用實時熒光定量PCR技術在腎結核組織切片中檢測結核分枝桿菌特異基因序列，評估實時熒光定量聚合PCR技術在腎結核病理診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2015年9月—2019年9月在我院泌尿外科通過后腹腔鏡技術或開放技術行腎切除術、病理科制作保存的石蠟包埋組織標本55例。以術前尿結核分枝桿菌檢測結果為金標準，并結合術后病理診斷結果，將研究標本分為結核腎病組(陽性組)25例，非結核腎病組30例(陰性組)。其中結核腎病組(陽性組)男性10例，女性15例；病變位于左側12例，右側13例；年齡35～60歲，中位年齡47.0歲。患者均有反復尿頻、尿急、尿痛等癥狀≥3個月，每個患者均收集3次晨尿標本，行BACTEC MGIT 960液體培養或羅氏固體培養，結果每個患者至少有1次尿標本結核分枝桿菌培養陽性。患者術前均診斷為活動性無功能腎結核(患側)，行后腹腔鏡或開放手術腎切除術，術后病理診斷HE染色為腎結核或符合腎結核。非結核腎病組(陰性組)：同一時期因腎結石、腎積水、腎外傷、腎腫瘤等行腎切除術或腎部分切除術的標本30例，其中無功能性腎結石3例，無功能性腎積水2例，創傷性腎碎裂傷2例，腎盂癌8例，腎癌15例，其中男性14例，女性16例；病變位于左側13例，右側17例；年齡35～65歲，中位年齡49.5歲。術前均采集3次尿標本行結核分枝桿菌培養，結果均陰性，且術后病理診斷均為非結核病。兩組性別、腎臟患側、年齡等一般資料差異均無統計學意義(P>0.05)，均有可比性。

本研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2納入標準 (1)結核腎病組納入標準：尿標本經BACTEC MGIT 960液體培養或羅氏固體培養結果為陽性，且病理診斷結果符合《中國結核病病理學診斷專家共識》[9]結核病病理診斷標準：①慢性肉芽腫伴壞死病變中找到經典結核結節；②慢性肉芽腫伴壞死病變中査到抗酸桿菌；③慢性肉芽腫伴壞死病變中未見經典結核結節或抗酸桿菌, 但臨床細菌學或影像學檢查支持結核診斷,并且抗結核治療有效；以上三條具備其中一條即可。(2)非結核腎病組納入標準：尿標本經BACTEC MGIT 960液體培養或羅氏固體培養結果為陰性，且術后病理診斷結果確診為非結核病變者。

1.3排除標準 符合以下條件者可不納入：標本病理診斷為其他感染性肉芽腫病變者。

1.4儀器與方法

1.4.1試劑及儀器 實時熒光定量PCR儀，型號ABI 7500，為我院分子實驗室提供，組織DNA提取試劑盒、結核分枝桿菌核酸測定試劑盒均購自成都博奧晶芯生物科技有限公司。抗酸染色試劑盒購自南京一基生化科技有限公司。

1.4.2DNA提取及PCR擴增檢測 ①所有石蠟組織標本連續切片5 μm×10張，置于消毒好的1.5 mL離心管中。②按照DNA提取試劑說明書操作步驟提取組織標本DNA。③DNA擴增：按照結核分枝桿菌核酸測定試劑盒說明書要求進行。PCR反應條件：92 ℃ 1 min→60 ℃ 1 min→72 ℃ 1 min，30個循環。在72 ℃進行熒光檢測。每批檢測標本均設置陰性對照、強陽性對照、臨界陽性對照。檢驗結果判定：Ct<40且擴增曲線呈典型S型為陽性，Ct≥40或無擴增曲線為陰性。

1.4.3抗酸染色檢測 石蠟組織標本切片厚4 μm，常規二甲苯脫臘并水洗。具體染色方法略，參見堿性復紅法(Ziehl-Neelsen)染色法[10]。結果判定：抗酸菌呈紅色桿狀，其他組織細胞或細菌呈藍色。

1.5統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件和Medcalc統計軟件進行數據處理。計量資料不滿足正態分布者采用兩組樣本比較的秩和檢驗(Mann-Whitney U)，計數資料采用兩組樣本比較的χ2檢驗，不滿足χ2檢驗條件時采用確切概率法。兩種檢測方法與術前尿標本BACTEC MGIT 960液體培養或羅氏固體培養結果一致性分析采用Kappa檢驗，Kappa≥0.75說明一致性較好，Kappa<0.4說明一致性較差，0.75>Kappa≥0.4說明一致性一般。計算兩種檢測方法診斷效能采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析，0.50.9表示有很高的診斷價值。兩種診斷的ROC曲線下面積比較采用Z檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1實時熒光定量PCR檢測及抗酸染色的檢測結果 本研究中熒光定量PCR檢測結果Ct<40且擴增曲線呈典型S型者為陽性，Ct≥40或無擴增曲線者為陰性。抗酸染色檢測呈紅色桿狀、略彎曲、串珠狀者為抗酸桿菌陽性，抗酸桿菌多見于壞死的中心區或壞死區與上皮樣肉芽腫的交界處。

2.2熒光定量PCR檢測及抗酸染色檢測的診斷效能 在本研究55例石蠟組織標本中，結核腎病組25例，非結核腎病組30例，熒光定量PCR與抗酸染色技術在兩組標本中檢測結果見表1。以術前尿標本BACTEC MGIT 960液體培養或羅氏固體培養結果為金標準，熒光定量PCR檢測石蠟組織標本結核分枝桿菌的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度分別為80.0%、96.7%、95.2%、85.3%、89.1%，一致性結果為Kappa=0.777,P<0.001(一致性較好)。抗酸染色檢測石蠟組織標本抗酸桿菌的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確度分別為48.0%、93.3%、85.7%、68.3%、72.7%，一致性結果為Kappa=0.429,P<0.001(一致性一般)。熒光定量PCR檢測的敏感度高于抗酸染色檢測的敏感度，兩組差異有統計學意義(χ2=5.556,P=0.018)。熒光定量PCR檢測的特異度、陽性預測值、陰性預測值均高于抗酸染色檢測的結果，但兩者比較差異均無統計學意義(P>0.05)。熒光定量PCR檢測的準確度高于抗酸染色檢測的準確度(89.1%vs.72.7%)，兩者比較差異有統計學意義(χ2=4.767，P=0.029)，見表2。

表1 熒光定量PCR與抗酸染色技術在兩組組織標本中的檢測結果Table 1 The detection results of fluorescent quantitative PCR and acid-fast staining technique in two groups of tissue samples (例數)

表2 熒光定量PCR技術與抗酸染色技術對腎結核組織病理的診斷效能Table 2 The diagnostic efficacy of fluorescent quantitative PCR and acid-fast staining technique for histopathological diagnosis of renal tuberculosis

2.3熒光定量PCR與抗酸染色對腎結核組織標本診斷價值的ROC曲線分析 根據不同檢測方法檢測樣本在選擇的各點上的敏感度和特異度，繪制ROC曲線，以術前尿標本BACTEC MGIT 960液體培養或羅氏固體培養結果為金標準擬合對腎結核組織標本診斷效能的ROC曲線，見圖1。分別以熒光定量PCR技術和抗酸染色技術為檢驗變量時，熒光定量PCR技術診斷的ROC曲線面積為0.883，有較高的診斷價值(0.8

圖1 兩種檢測方法對腎結核組織標本診斷效能受試者工作特征曲線分析結果

表3 兩種檢測方法的ROC曲線下面積值及比較Table 3 The area under the ROC curve of two detection methods and their comparison

3 討 論

結核病的分子生物學檢測開展較早，WHO于2013 年、我國于2017 年分別修訂了診斷標準，已將分子生物學技術作為病原學檢測的重要依據。分子生物學技術不僅可以檢測病原菌的核酸，還可以深度鑒定不同菌種、檢測耐藥基因。目前采用的技術包括：即時熒光定量 PCR、等溫擴增技術、探針-熔解曲線技術、基因測序技術、二代測序及液相芯片等[11-15]。

對于腎結核，尿結核桿菌培養最有診斷價值，但敏感度變化較大，且同樣存在培養周期長、延誤治療等問題，尿沉渣抗酸染色檢測存在敏感度低，易污染，不能有效排除其他抗酸染色陽性菌干擾(如包皮垢分枝桿菌)等問題[16-17]。尿結核分枝桿菌DNA檢測對結核桿菌具有較高特異度以及敏感度,國外有研究報道以尿結核分枝桿菌培養陽性為金標準，PCR檢測尿TB菌的敏感度達95.6%，特異度達98.1%，而國內有研究報道的敏感度為80.0%，特異度為78.5%[18-19]。因尿標本中存在某些擴增抑制藥物，或標本易被污染等，使得該檢查易出現假陰性或假陽性結果。

本研究中采用敏感度及特異度較高的分子生物學方法實時熒光定量PCR技術檢測腎組織上的結核分枝桿菌特異DNA序列，以術前尿結核分枝桿菌培養結果為金標準，并結合術后腎臟切除標本病理診斷結果，將研究對象分為陽性組和陰性組，并通過與同組腎組織標本抗酸染色檢測結果對比，研究實時熒光定量PCR技術在腎結核病理診斷中的診斷效能，以期對臨床診斷提供依據。

本研究發現，熒光定量PCR檢測石蠟組織標本結核分枝桿菌的敏感度、特異度分別為80.0%、96.7%，與術前尿結核分枝桿菌培養陽性金標準進行一致性檢驗，結果為Kappa=0.777，診斷一致性較好。在本研究顯示：①實時熒光定量PCR技術在腎結核確診病例組織切片中檢測的敏感度為80.0%，與文獻報道的在尿沉渣標本中檢測的敏感度有稍許差距，提示PCR檢測敏感度在不同介質標本(液體、固體組織)中有差別，臨床應用中應注意相關區別。②腎組織實時熒光定量PCR檢測的敏感度較抗酸染色敏感度提高32.0%，差異有統計學意義。腎組織實時熒光定量PCR檢測的準確度亦明顯高于抗酸染色檢測結果，差異有統計學意義。實時熒光定量PCR技術和抗酸染色技術的ROC曲線下面積分別為0.883和0.707,前者高于后者0.177,差異有統計學意義(Z=3.502，P<0.05)。這充分提示在腎結核病理診斷中，實時熒光定量PCR技術較抗酸染色技術在病原學檢測方面具有更大的應用價值。本研究對腎組織標本進行結核分枝桿菌核酸基因檢測，既擴展了實時熒光定量PCR技術在結核分枝桿菌檢測領域的應用范圍，同時也增加了腎結核病理診斷的技術手段，并最終提高了腎結核的病理診斷準確度。

本研究腎結核組(研究組)中組織熒光定量PCR檢測陽性20例，其中9例抗酸染色陽性，11例抗酸染色陰性，分析可能原因：抗酸染色檢測的敏感度低于熒光定量PCR的檢測結果，在行充分抗結核治療后組織標本結核菌量水平明顯降低的情況下，抗酸染色的敏感度會進一步降低，假陰性率升高。腎結核組中抗酸染色檢測陽性12例，其中11例熒光定量PCR檢測陽性，1例陰性，考慮可能原因：①抗酸染色陽性標本中存在非結核分枝桿菌感染者；②抗酸染色陽性標本中存在擴增反應抑制物，抑制PCR擴張，導致熒光定量PCR檢測陰性。在本研究陰性組(非結核腎病組)中熒光定量PCR檢測假陽性1例，考慮與標本間污染有關，需加強實驗室的清潔、消毒工作，提高檢測過程的質量控制標準。陰性組中抗酸染色檢測假陽性2例，考慮除與標本之間污染有關外，可能有非結核分枝桿菌(如包皮垢分枝桿菌)、諾卡菌屬、軍團菌屬等抗酸染色陽性菌干擾有關，需通過熒光定量PCR檢測或結核桿菌培養區分結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌，提高檢測的特異性。

綜上所述，實時熒光定量PCR技術檢測方法簡單易行，與抗酸染色檢測技術相比可以提高腎結核病原體檢測的敏感度和準確度，在腎結核的病理診斷中具有良好的應用價值。