PGT-A及PGT-SR在輔助生殖中的應用

宋春蘭，左海洋，王 偉，陳 甫，商 微*

(1.中國人民解放軍總醫院第六醫學中心生殖中心，北京 100037；2.中國人民解放軍總醫院第七醫學中心婦產醫學部，北京 100700)

植入前遺傳學檢測(preimplantation genetic testing，PGT)技術的發展逐步應用于單基因病、染色體病等遺傳性疾病的預防，為高齡和反復流產等患者帶來了希望，通過對植入子宮前的胚胎進行遺傳學檢測，選擇不攜帶致病基因和異常染色體的整倍體胚胎移植，能夠提高輔助生殖的妊娠率，阻斷遺傳性疾病向子代傳遞。PGT主要分為植入前遺傳學非整倍體檢測(PGT for aneuploidies，PGT-A)、染色體結構重排檢測(PGT for structural rearrangements，PGT-SR)和單基因病檢測(PGT for monogenic，PGT-M)[1]。本研究對行PGT-A及PGT-SR的患者進行了分析，為此類患者的遺傳咨詢提供依據，為PGT技術的推廣與臨床應用提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2018年1月—2019年12月于中國人民解放軍總醫院第六醫學中心行PGT-A及PGT-SR助孕夫婦的臨床資料。排除標準：體外受精-胚胎移植禁忌證。共納入PGT-A 194個周期，635個胚胎，101個移植周期；共納入PGT-SR 92個周期，399個胚胎，40個移植周期。

本研究經醫院倫理委員會審批通過。

1.2研究方法

1.2.1控制性超促排卵、受精及胚胎培養 所有患者采用合適的方案促排卵。注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)36 h后行陰道超聲引導下取卵術。均采用卵泡漿內單精子顯微注射受精方式，取卵后第1天觀察卵子受精情況，雙原核為正常受精。第5～7天行囊胚期胚胎(滋養細胞)活組織檢查取樣。活組織檢查后的胚胎行常規玻璃化冷凍單個存放。

1.2.2胚胎檢測 采用MALBAC專利技術(即多次退火環狀循環擴增技術)對胚胎活檢樣本進行全基因組擴增，利用酶切打斷建庫的方法進行測序文庫構建，通過高通量測序結合生物信息學分析胚胎染色體非整倍體等異常情況。

1.2.3凍融胚胎移植、黃體支持及隨訪 選擇活組織檢查檢測正常的胚胎進行單胚胎移植，黃體支持采用雌激素聯合孕激素，移植后1周檢測血清HCG，HCG陽性者移植后約4周行陰道超聲檢查，觀察宮腔內孕囊數目及有無胎心搏動以確定臨床妊娠，期間根據患者激素水平保胎，統計生化妊娠率、臨床妊娠率；后期電話隨訪本周期妊娠情況及結局，隨訪羊水穿刺染色體檢查結果、性別、出生體重、妊娠孕周及有無先天畸形等情況，統計流產率、持續妊娠率、活產率。生化妊娠：胚胎移植后 7～14 d HCG >25 U/L。臨床妊娠：移植后約4周，陰道超聲檢查可見宮腔內妊娠囊。流產：妊娠28周前妊娠終止。持續妊娠：妊娠持續到20周及以后。活產：妊娠≥28周后分娩活嬰。

1.3分組情況 將PGT-A患者根據年齡分為年輕女性(<35歲)組與高齡女性(≥35歲)組，比較分析2組基本情況、胚胎情況、移植結局。為更好比較不同年齡階段的PGT-A助孕女性的結局，將高齡女性進一步分為35～37歲組、38～39歲組、40～41歲組及≥42歲組，與<35歲組比較基本情況、胚胎情況、移植結局。將PGT-SR患者根據年齡分為年輕女性(<35歲)組與高齡女性(≥35歲)組，比較分析2組基本情況、胚胎情況、移植結局。因PGT-SR周期較少，故不再將高齡組進一步分組。

1.4統計學方法 應用 SPSS23.0統計軟件分析數據。非正態分布的計量資料比較采用非參數秩和檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1PGT-A

2.1.1患者一般資料 共納入194個周期，送檢635個胚胎，移植101個周期。年輕女性組(<35歲)共43個周期、199個胚胎，平均年齡(31.81±2.03)歲；高齡組(≥35歲)共151個周期、436個胚胎，平均年齡(39.43±2.80)歲。<35歲組和≥35歲組體重指數(body mass index,BMI)、基礎促卵泡生成素(follicle stimulating hormone,FSH)、基礎促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、不孕類型、復發性流產差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。將高齡女性進一步分為35～37歲組、38～39歲組、40～41歲組及≥42歲組，與<35歲組比較，基礎FSH差異有統計學意義(P<0.05)，各組間體重指數、基礎LH、不孕類型、復發性流產差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 <35歲組及≥35歲組PGT-A 臨床基本情況比較Table 1 Comparison of general clinical data of PGT-A between patients <35 years of age and patients ≥35 years of age

表2 不同年齡組PGT-A 臨床基本情況比較Table 2 Comparison of general clinical data of PGT-A among different age groups

2.1.2胚胎情況比較 <35歲組平均獲卵數高于≥35歲組，差異有統計學意義(P<0.05)；2組獲卵率、卵子成熟率、正常受精率、卵裂率、優質胚胎率、優質胚胎形成有效囊胚率、囊胚形成率、可利用囊胚率、有效囊胚率差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。將高齡女性進一步分為35～37歲組、38～39歲組、40～41歲組及≥42歲組，與<35歲組比較，各組間獲卵數、卵子成熟率差異有統計學意義(P<0.05)，余各項差異無統計學意義(P>0.05)，見表4；≥35歲組正常胚胎率明顯低于<35歲組，差異有統計學意義(P<0.05)，將高齡女性進一步分為35～37歲組、38～39歲組、40～41歲組及≥42歲組，與<35歲組比較，各組間正常胚胎率差異有統計學意義(P<0.05)，見表5，6。

表3 <35歲組及≥35歲組PGT-A胚胎情況比較Table 3 Comparison of embryonic status of PGT-A between patients <35 years of age and patients ≥35 years of age [M(QR)]

表4 不同年齡組PGT-A胚胎情況比較Table 4 Comparison of embryonic status of PGT-A among different age groups [M(QR)]

表5 <35歲組及≥35歲組PGT-A胚胎活組織檢查結果比較Table 5 Comparison of embryo biopsy results of PGT-A between patients <35 years of age and patients≥35 years of age (胚胎數，%)

表6 不同年齡組PGT-A胚胎活組織檢查結果比較Table 6 Comparison of embryo biopsy results of PGT-A among different age groups (胚胎數，%)

2.1.3移植結局比較 <35歲組共移植40個周期，臨床妊娠17例，活產17例，均為足月產。≥35歲組共移植61個周期，臨床妊娠32例，活產27例，其中1例早產。所有子代均健康。2組生化妊娠率、臨床妊娠率、流產率、持續妊娠率及活產率差異無統計學意義(P>0.05); 將高齡女性進一步分為35～37歲組、38～39歲組、40～41歲組及≥42歲組，與年輕女性組(<35歲)比較，生化妊娠率、臨床妊娠率、流產率、持續妊娠率及活產率差異無統計學意義(P>0.05)。見表7，8。

表7 <35歲組及≥35歲組PGT-A 移植結局比較Table 7 Comparison of embryo transfer outcome of PGT-A between patients <35 years of age and patients ≥35 years of age (周期數，%)

表8 不同年齡組PGT-A 移植結局比較Table 8 Comparison of embryo transfer outcome of PGT-A among different age groups (周期數，%)

2.2PGT-SR

2.2.1患者一般資料 共納入92個周期，送檢399個胚胎。<35歲組共63個周期、277個胚胎，平均年齡(31.06±2.06)歲；≥35歲組共29個周期、122個胚胎，平均年齡(38.28±2.20)歲。2組基礎FSH差異有統計學意義(P<0.05)，BMI、基礎LH、不孕類型、復發性流產差異無統計學意義(P>0.05)，見表9。

表9 PGT-SR臨床基本情況比較Table 9 Comparison of general clinical data of PGT-SR

2.2.2胚胎情況比較 <35歲組平均獲卵數高于≥35歲組，差異有統計學意義(P<0.05)；2組獲卵率、卵子成熟率、正常受精率、卵裂率、優質胚胎率、優質胚胎形成有效囊胚率、囊胚形成率、可利用囊胚率、有效囊胚率差異無統計學意義(P>0.05)，見表10；≥35歲組正常胚胎率明顯低于<35歲組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表11。

表10 2組PGT-SR胚胎情況比較Table 10 Comparison of embryonic status of PGT-SR between two groups [M(QR)]

表11 PGT-SR 2組胚胎活組織檢查結果比較Table 11 Comparison of embryo biopsy results of PGT-SR between two groups (胚胎數，%)

2.2.3移植結局比較 <35歲組共移植31個周期，臨床妊娠14例，流產2例，活產12例，均為足月產。≥35歲組共移植9個周期，臨床妊娠8例，流產1例，活產7例，均為足月產。所有子代均健康。2組生化妊娠率、臨床妊娠率、流產率、持續妊娠率及活產率差異無統計學意義(P>0.05)。見表12。

表12 2組PGT-SR移植結局比較Table 12 Comparison of embryo transfer outcome of PGT-SR between two groups (周期數，%)

3 討 論

PGT至今已有20余年，主要應用于復發性流產、高齡、染色體病和單基因病等患者，目前通過染色體非整倍體檢測、染色體病檢測和單基因病檢測技術阻斷了遺傳缺陷向子代傳遞，改善了這些患者的臨床妊娠結局。早期，PGT分為植入前遺傳學診斷和植入前遺傳學篩查兩個部分[2]。PGD適用于單基因病和染色體病患者，PGS適用于女方高齡、反復流產、反復種植失敗和嚴重男性因素不育患者。2017年，國際輔助生殖技術監控委員會對PGT進行了新的分類，包括PGT-A、PGT-SR、PGT-M三個部分[1]。PGT-A用于女方高齡、反復流產、反復種植失敗和嚴重男性因素不育患者，能夠篩查出非整倍體胚胎，而胚胎非整倍體是導致早期流產最常見的原因之一[3]。PGT-SR適用于易位、倒位、重復、缺失等染色體結構異常患者，可以發現胚胎的拷貝數變異，通過移植不攜帶缺失和重復的整倍體胚胎，降低因染色體不平衡導致的反復移植失敗及早期流產的發生。單基因病患者攜帶的致病基因遺傳給子代，會導致子代患病，加重家庭負擔。PGT-M可以篩選出不攜帶致病基因的胚胎，阻斷遺傳缺陷，獲得健康后代[4]。

近年來，微陣列芯片和二代測序等PGT技術不斷發展，提高了檢測準確性，降低了誤診率，但仍然存在檢測時間長、成本高、等位基因脫扣和無法識別染色體平衡易位等問題[5]。針對以上問題，近來有新的技術方法應用于臨床，能準確識別攜帶致病基因的染色體，鑒別易位攜帶狀態的胚胎，提高異常胚胎的檢出率，改善子代的臨床結局[6-7]。

本研究結果顯示，PGT-A助孕人群，≥35歲組獲卵數少于<35歲組，其后胚胎發育差異無統計學意義，胚胎活組織檢查后≥35歲組正常胚胎率明顯低于<35歲組，PGT-SR結果中也存在此現象，且隨著年齡增長，胚胎活組織檢查染色體異常率逐漸升高，因此胚胎形態學評價并不能反映胚胎染色體是否正常，胚胎染色體異常與女方年齡密切相關。在一項對12 298個胚胎進行PGT-A的研究中，結果顯示,年齡>35歲的女性整倍體率隨著年齡的增長而急劇下降，活組織檢查胚胎的數量也隨著年齡的增長而減少，特別是對于年齡>37歲的女性[8]。在一項前瞻性多中心研究提示，胚胎整倍體水平與年齡呈負相關，非整倍體水平與年齡呈正相關[9]。

既往很多研究發現，隨著女性年齡增長，胚胎非整倍體率逐漸升高，<35歲女性囊胚非整倍體率約32%，此概率隨年齡增加不斷升高，≥42歲女性的囊胚非整倍體率已高達85%[10-11]。本研究結果顯示，PGT-A中<35歲女性異常胚胎率為39.20%，≥35歲女性異常胚胎率為63.76%；在染色體結構異常夫婦中，<35歲女性異常胚胎率為56.32%，≥35歲女性異常胚胎率為83.61%。相較于無染色體結構異常的女性，染色體結構異常女性的胚胎染色體異常比率較高，存在更高的流產風險。PGT-SR患者中包括平衡易位、羅氏易位、倒位等多種染色體異常，染色體異常類型及異常所在染色體位置可能與染色體非整倍體發生率有關[12-14],夫婦一方或雙方染色體結構異常導致子代非整倍體率明顯升高[15-16]。

胚胎染色體異常是造成高齡女性自然流產等不良妊娠結局的主要因素。高齡女性胚胎染色體異常導致反復流產，增加了女性的生理、心理及經濟負擔。經過PGT后，移植染色體平衡的胚胎，高齡女性與年輕女性移植結局差異無統計學意義，說明當去除胚胎染色體異常這一因素后，高齡女性可獲得同年輕女性相似的妊娠結局，從而減少流產的發生，減輕患者的痛苦。但臨床中，需要考慮的更多。本研究結果顯示，隨著女性年齡的增長，胚胎活組織檢查正常率逐漸下降，40～41歲女性胚胎活組織檢查正常率為29.13%，≥42歲女性胚胎活組織檢查正常率僅為10.39%，且年齡越大，胚胎嵌合體發生率越高，導致最終無可移植囊胚，所以，對于40歲以上女性，尤其超過42歲女性，是否行PGT值得臨床醫生權衡利弊。有研究發現，高齡女性行PGT-A助孕的周期取消率增高，尤其對于卵巢功能減退、胚胎少的高齡女性，是否行PGT-A應權衡利弊后決定[17]。

本研究結果顯示，PGT-A中，共移植101個胚胎，活產44例，活產率達43.56%，PGT-SR中，共移植40個胚胎，活產19例，活產率達47.50%，可見PGT是解決復發性流產、高齡女性、染色體異常夫婦等的有效治療手段，PGT的臨床應用尤其能夠有效改善高齡女性的生育狀況。

本研究亦存在不足，為回顧性研究，可能存在未知偏移影響統計結果；納入樣本量偏少，尤其移植周期數偏少，可能影響統計學效力，待更多前瞻性研究進一步支持。

綜上所述，PGT是解決復發性流產、高齡女性、染色體異常夫婦等的有效治療手段，PGT的臨床應用尤其能夠有效改善高齡女性的生育狀況，但并不適合所有高齡的女性，尤其40歲以后的女性。目前國內可開展PGT技術的生殖中心有限，很多中心處于PGT起步階段，國內關于PGT臨床結局的研究有限，對于40歲以后的女性患者，其治療方案應個體化、權衡利弊綜合考量。