多囊卵巢綜合征卵泡內信號轉導通路與高雄激素血癥的關系

顏孟晗，孫振高，曹靖先，侯金偉，姜文晶，王丹丹

(1.山東中醫藥大學中醫學院，濟南 250014；2.山東中醫藥大學附屬醫院，濟南 250014；3.山東中醫藥大學第一臨床學院，濟南 250014)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是最常見的生殖內分泌和代謝疾病之一，在排除其他可能引起高雄激素的疾病和引起排卵異常的疾病后，滿足月經稀發或閉經或不規則子宮出血的必需條件，再符合高雄激素臨床表現或高雄激素血癥(HA)、超聲下表現為多囊卵巢兩個條件其中之一，則可診斷為PCOS[1]。部分患者還伴有胰島素抵抗和肥胖，使患有PCOS的女性患糖尿病和心血管疾病的風險更高，生活質量顯著下降。此外PCOS是導致無排卵性不孕癥的常見原因之一，卵泡生長在腔前階段被抑制，最終形成充滿液體的囊腫導致這些婦女無排卵性不孕。盡管研究發現各種細胞內信號通路與PCOS的類固醇生成和雄激素的作用有關，但其病因至今尚未闡明。

高雄激素血癥是PCOS的顯著特征之一，也可能是導致PCOS的病因之一，臨床常表現為多毛、痤瘡、男性型脫發、皮脂分泌增多等癥狀[1-2]，實驗室檢查血清中雄激素水平升高，如：總睪酮(TT)、游離睪酮(FT)、脫氫表雄酮(DHEA)、雙氫睪酮(DHT)、雄烯二酮(A)等[3]。在PCOS患者的血清中檢測到生物利用睪酮水平提高，性激素結合球蛋白水平降低，此外，黃體生成素(LH)水平也升高[2-4]。PCOS雄激素和雌激素的異常合成主要來源于卵泡膜細胞和顆粒細胞，部分來自腎上腺皮質。

雄激素的生成與多個信號轉導通路的作用有關，多種參與信號轉導通路的蛋白、脂質、mRNA及其他相關因子在PCOS患者卵泡膜細胞、顆粒細胞和卵泡液內被發現存在表達差異[5-6]，使雄激素向雌激素的轉化受到抑制，最終導致雄激素水平升高。高雄激素水平又會影響卵泡的生成、發育及排出。現從PCOS中雄激素合成和雄激素升高影響PCOS兩個方面對高雄激素型PCOS卵泡內信號轉導通路的異常改變進行綜述。

一、PCOS雄激素合成相關的信號轉導通路

睪酮可以通過芳香化酶轉化為雌二醇。睪酮和雌二醇協同維持女性生殖內分泌系統的平衡。卵巢分泌過多的雄激素被認為是PCOS最重要的誘發因素。細胞色素P450 17α-羥化酶(CYP17)基因是卵泡膜細胞表達的多種編碼類固醇生成成分基因的一種，具有17α-羥化酶活性，使孕烯醇酮和孕酮發生17-羥化；同時具有C17，20-裂解酶活性，可使17-羥孕烯醇酮轉化為DHEA、17-羥孕酮轉化為A[7]。PCOS患者卵泡膜細胞中CYP17A1表達上調，導致雄激素積累過多，內源性類固醇生成失調。同時，在卵巢顆粒細胞中，也有一種可將雄激素轉化為雌激素的酶——CYP19A1[8]，在PCOS中被發現表達下調，從而抑制了雄激素向雌激素的轉化。PCOS中雄激素的異常合成和積累可能是導致PCOS高雄激素血癥的原因。PCOS雄激素合成與多個信號轉導通路的作用有關(圖1)[5]

1.IRS-PI3K通路：胰島素對卵泡膜雄激素生物合成的影響是由胰島素受體介導的，胰島素受體激活后，通過使細胞內底物磷酸化，尤其是胰島素受體底物(IRS)，啟動細胞內信號轉導，從而發揮作用。磷酸化IRS將激活的胰島素受體與包括磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)在內的下游信號傳導介質聯系起來[9-10]。PI3K是胰島素增強卵泡膜17α-羥化酶活性的重要介質。Yen等[9]發現PCOS卵泡膜細胞胰島素受體底物IRS-1、IRS-2升高，IRS-4降低。卵泡膜細胞IRS-1和IRS-2含量的增加可能導致PI3K活性的增加，與cAMP/PKA信號通路相互作用，通過增強卵泡膜17α-羥化酶的活性導致雄激素分泌增加。但Wang等[10]發現IRS-2和PI3K在顆粒細胞中表達降低，同時證實了其下游蛋白磷脂酰肌醇依賴激酶-1(PDK-1)和雷帕霉素的哺乳動物靶點(mTOR)的表達也顯著降低。mTOR參與顆粒細胞的凋亡[11]，這可能與無排卵和胰島素抵抗有關[12]。

2.LKB1-IGF軸：肝激酶b1(LKB1)作為一種多功能激酶，參與腫瘤抑制的調節、細胞能量的內穩態、極性的構建和血管的生成。LKB1在卵泡膜細胞中下調CYP17A1，在顆粒細胞中上調CYP19A1，從而抑制雄激素的產生并促進雌激素的產生可在體內抵抗HA。研究發現HA-PCOS卵巢中過量的雄激素通過雄激素受體(AR)抑制LKB1的轉錄和翻譯[13]。此外，胰島素樣生長因子受體(IGFR)的缺乏減弱了LKB1觸發的CYP17A1的下調和CYP19A1的上調[13]，表明IGF通路參與了LKB1對雌激素和雄激素產生的影響。在HA-PCOS中LKB1被抑制，減弱了雄激素產生的負調控，雄激素生成被促進，最終導致HA。

圖1 PCOS雄激素合成相關的信號通路圖[5]

3.MAPK/ERK信號通路：絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是從胞漿到細胞核的信號轉導介質，MAPKs是脯氨酸導向的絲氨酸-蘇氨酸激酶，它在蘇氨酸和酪氨酸上被磷酸化(即被激活)，從而響應多種刺激，包括細胞因子、生長因子、激素、細胞應激和細胞粘附等[14]。最近有研究證明，MAPK信號通路與LH、FSH誘導的類固醇生物合成有關。Liu等[15]表明，MAPK信號通路可能參與了卵泡液內成纖維細胞生長因子13對總睪酮水平的調節。另外，通過細胞外信號相關激酶(ERK)和環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(ERK-CREB)途徑與調節雄激素生物合成有關[16]。有研究發現，與正常膜細胞相比，PCOS膜細胞中MAPK激酶(MEK1/2)磷酸化降低70%，細胞外調節激酶(ERK1/2)磷酸化降低50%，這提示MEK/ERK磷酸化的降低與PCOS患者雄激素分泌過多有關[16-17]。

有研究表明，MEK1/2和ERK1/2的激活直接抑制了卵泡膜細胞CYP17 mRNA的積累和雄激素的生物合成，促進CYP19A1(將雄激素轉化為雌激素的酶)的產生[18]。此外，Zhang等[19]還發現，在HA-PCOS患者血清miR-125b-5p表達明顯降低，并證實miR-125b-5p通過PAK3介導ERK1/2信號通路，在HA-PCOS類固醇生成缺陷的發生中起著關鍵作用。這證明了在高水平LH作用下，PCOS患者膜細胞MEK和ERK信號的改變可促進CYP17基因的表達，抑制CYP19A1基因的表達，從而使雄激素分泌增多，雌激素分泌減少。

4.AKAP95-cAMP/PKA信號通路：CYP19A1在顆粒細胞中在FSH的誘導下將T轉化為E2。A激酶錨定蛋白95(AKAP95)可在顆粒細胞細胞核內錨定PKA，FSH與FSH受體結合后，PKA與cAMP結合后啟動cAMP/PKA信號通路，參與cAMP反應元件結合蛋白(CREB)的磷酸化，隨后磷酸化的CREB與CYP19A1基因啟動子中的cAMP反應元件結合，導致人卵巢顆粒細胞中CYP19A1的轉錄激活，促進的生成E2[20]。從PCOS患者獲得的人黃體顆粒細胞中觀察到AKAP95水平顯著降低，減少了PKA錨定在細胞核中的數量，并減弱CREB的磷酸化，從而抑制PCOS顆粒細胞中CYP19A1表達，使雄激素向E2的轉化減少，抑制E2合成[20]。這表明，PCOS患者AKAP95水平降低可能是導致其高雄激素血癥的原因之一。

5.褪黑素-ERK途徑：褪黑素是松果體分泌的一種神經內分泌激素，可影響卵巢的類固醇生成、卵泡生成和卵母細胞成熟。褪黑素可保護卵母細胞免受自由基的傷害，在卵母細胞發育過程中發揮重要作用。Yu等[21]發現，褪黑激素通過ERK途徑促進CYP19A1的上調，促進顆粒細胞內E2的合成。但在PCOS患者卵泡液內，褪黑素水平降低，抑制CYP19A1表達，雄激素向雌激素的轉化受到干擾，導致雄激素異常積累，可能是導致高雄激素血癥的誘因之一。

6.miR-130b-3p-DENND1A.V2/CYP17A1調控：miR-130b-3p是在PCOS卵泡膜細胞發現的差異表達的mRNA之一，在PCOS卵泡膜細胞中的表達降低[22]。miR-130b-3p被證實參與了與雄激素合成有關的復雜的調控網絡，與MAPK1、PI3K和cAMP/PKA信號通路有關，從而使雄激素分泌增多；DENND1A變異體2(DENND1A.V2)是DENND1A的一種截短亞型，在PCOS膜細胞中被發現上調，并通過介導PCOS膜細胞CYP17A1mRNA和CYP11A1mRNA的表達，刺激雄激素生物合成的增強；同時，miR-130b-3p被發現與DENND1A.V2 mRNA、CYP17A1 mRNA的表達和DHEA的積累之間存在顯著的負相關；在卵泡膜細胞中miR-130b-3p的表達降低與DENND1A.V2、CYP17A1表達上調有關，使雄激素合成增加[22]。

7.NF-κB信號通路：越來越多的人認為慢性炎癥是PCOS發病機制的一個重要因素，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種眾所周知的炎癥因子，被證明是PCOS相關生理過程的潛在介導者。TNF-α可激活NF-κB信號通路誘導炎癥反應，也促進CYP17A1的表達，并在mRNA和蛋白質水平顯著抑制CYP19A1的表達；同時發現TNF-α抑制劑能有效緩解PCOS的臨床癥狀，在臨床治療PCOS方面抗TNF-α治療有望與常規治療相結合[23]。攜帶S100鈣結合蛋白A9(S100-A9)的外顯子也能夠激活NF-κB通路，增加炎癥反應，并通過NF-κB途徑依賴的方式顯著增加了CYP17 mRNA的表達，而略微抑制了CYP19A1的表達，破壞類固醇生成[24]。

8.BMP4-Smad信號通路：卵泡內骨形態發生蛋白信號通路對卵泡膜雄激素產生的負調節[25]。骨形態發生蛋白4(BMP4)是一種分泌性蛋白，可以結合兩種不同的Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，受體被激活后，反過來通過BMP4傳遞細胞內信號，激活Smad和MAPK途徑，可下調CYP17A1蛋白水平，而上調CYP19A1蛋白水平，從而抑制卵巢卵泡膜細胞中雄激素的合成，促進顆粒細胞中雌激素的產生。在雄激素水平過高的小鼠PCOS模型中，雄激素受體在睪酮作用下可與BMP4啟動子結合，抑制BMP4的表達；高雄激素血癥時卵巢BMP4水平顯著降低，BMP4介導的雄激素合成的負調節Smad信號通路被抑制，從而使雄激素水平進一步升高[26]。這提示卵巢高雄激素性功能障礙可能是卵泡膜骨形態發生蛋白信號通路自身調節缺陷的結果。

二、PCOS雄激素升高相關的信號轉導通路

雄激素在哺乳動物卵泡生長、成熟和黃體化中作為自分泌或旁分泌劑發揮重要作用，可在卵泡發育的不同階段，促進或抑制卵泡生長[27]。雄激素刺激顆粒細胞增殖，促進腔前卵泡生長，后又通過誘導顆粒細胞凋亡，使卵泡發育至某種特定的狀態后停止發育，導致卵泡閉鎖，影響優勢卵泡的生成及排卵過程，從而使卵巢發生多囊樣改變[28-29]。

1.AMPK/ERK1/2信號通路：在高雄激素水平下，抑制ERK1/2磷酸化可能影響卵泡發育。Kayampilly等[30]發現，DHT以時間和劑量依賴的方式激活AMPK(一種能量敏感機制)，抑制卵泡刺激素介導的ERK1/2磷酸化，同時導致細胞周期抑制劑分子p27 kip的表達增加，導致顆粒細胞的增殖被抑制。Ji等[31]研究結果表明，一種維持GCs處于非黃體化和高度增殖狀態的卵泡發育調節因子——YAP1，被LH通過ERK1/2級聯導致失活，在完全發育的卵泡中啟動排卵程序，但HA可能通過激活YAP1阻斷LH的作用并導致排卵不足。

2.雄激素受體多泛素化：雄激素通過刺激卵母細胞衍生因子生長分化因子9(GDF9)，促進顆粒細胞增殖和腔前卵泡生長[32]。PCOS患者顆粒細胞中高雄激素水平常導致無排卵。雄激素通過與雄激素受體(AR)的結合和激活來發揮基因組效應。AR信號轉導受多種翻譯后修飾的調控，如泛素化。泛素包含7個賴氨酸殘基K-6、11、27、29、33、48和63，泛素化鏈(多泛素化)通過這些殘基延伸，與底物結合[32]。環指蛋白6(RNF6)可介導K48位點特異性AR多泛素化、增加AR蛋白酶體降解，從而下調竇卵泡中AR的含量，抑制GDF9的表達，導致竇性卵泡生長停滯[32]。這提示PCOS患者長期高雄激素水平可能會使顆粒細胞中RNF6上調，介導AR下調，從而抑制GDF9表達，導致竇性卵泡生長停滯。

3.DHT-PI3K途徑-AQP-9：水通道蛋白(AQP)家族是存在于某些膜中的水特異性通道蛋白。有腔卵泡的發育，在促性腺激素的刺激下，需要快速大量的水轉運以增大竇腔的大小，因此AQP-9可能在其中起作用。研究結果表明，PCOS患者卵泡液中高DHT可使GCs中AQP-9 mRNA表達降低，PI3K通路可能參與該過程[33]。這些發現表明PCOS患者的高雄激素血癥可導致AQP-9表達減少，使顆粒細胞功能受損，從而阻礙卵泡發育。

4.FBP1信號通路：果糖-1，6-二磷酸酶1(FBP1)是糖異生的關鍵調節酶，催化果糖-1，6-二磷酸水解為果糖-6-磷酸和無機磷酸。在卵巢中，FBP1主要在卵母細胞、顆粒細胞和卵泡膜間質細胞中表達。FBP1、葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基(G6PC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PCK1)可在PGC-1(肝臟糖異生的關鍵調節劑和肝臟胰島素cAMP軸的中心靶點)的誘導下，使葡萄糖輸出增加。研究表明，在高濃度睪酮抑制卵泡發育的同時，在顆粒細胞中檢測到高濃度睪酮可使FBP1和PCK1的mRNA表達水平增加[34]。胰島素介導的Akt途徑參與卵泡的生長發育，該途徑抑制了G6PC和PCK1基因表達。這些結果表明，FBP1信號通路可能參與高雄激素血癥誘導的卵泡異常發育，但機制尚不明確，可能與高濃度睪酮誘導的胰島素代謝異常和糖代謝異常有關。

5.MAPK/ERK信號通路-線粒體：卵泡閉鎖是維持卵泡發育正常的重要因素。線粒體可通過調節活性氧的產生在細胞凋亡和細胞存活中發揮重要的作用，從而影響卵母細胞質量、卵泡生長發育和顆粒細胞增殖。MAPK/ERK信號通路可啟動線粒體生物合成，降低細胞凋亡率。在高雄激素血癥環境下，小鼠PCOS模型卵巢中卵泡閉鎖數量增加，同時顆粒細胞中的MAPK/ERK信號通路的活性降低，線粒體生物發生基因，包括過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC1α)和核呼吸因子1(NRF 1)也被發現下調[35]。因此，PCOS卵泡閉鎖可能與線粒體生物合成有關。Safaei等[35]同時發現，維生素D3可通過磷酸化和活化MAPK/ERK途徑，減輕顆粒細胞的凋亡。

6.PTEN-PI3K/Akt途徑：胰島素樣生長因子-I(IGF-I)的生物學功能主要是通過I型胰島素樣生長因子受體(IGF-IR)介導的，通過誘導Akt磷酸化，激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt途徑，刺激顆粒細胞的增殖。PI3K產生磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(PIP3)，通過磷酸化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸，激活包括Akt在內的多個下游效應器。同源性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)通過將PIP3去磷酸化為磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸來拮抗PI3K的活性，間接抑制Akt的磷酸化，提示PTEN通過調節PI3K/Akt途徑參與調節卵巢顆粒細胞的增殖和分化。胰島素誘導的PTEN表達可能參與了PCOS患者卵泡發育和黃體化的紊亂以及顆粒細胞功能的調節[36]。He等[37]發現在KGN(人顆粒樣腫瘤細胞系)細胞中，PTEN是miR-200b和miR-200c的直接靶點，在PCOS中miR-200b和miR-200c的表達增強，提示miR-200b和miR-200c可能通過靶向PTEN抑制顆粒細胞的增殖，從而影響卵泡的發育。

綜上所述，與PCOS高雄激素血癥相關的信號轉導通路眾多，且它們之間可能形成復雜的調控網絡。還有許多分子在PCOS中被發現上調或下調，但它們的作用機制仍不明確，有待于進一步研究。探討高雄激素型PCOS患者卵泡中相關信號轉導通路的改變及介質的表達差異，雖然PCOS的病因仍未明確，但這有助于揭示PCOS高雄激素血癥的病理生理學，可以更準確地定位PCOS高雄激素血癥的治療靶點，并啟發新的策略來預防該綜合征以及治療其癥狀和減輕長期并發癥的風險，降低PCOS患者的不孕率。