外源鈣和銅對黑豆芽苗菜生長及生理活性物質的影響

趙文欣，劉凱凱，徐 偉，張慧芋，劉昌斌，馬 茹，祁澤偉，張 超，薛建福

（山西農業大學農學院/黃土高原特色作物優質高效生產省部共建協同創新中心/作物生態與旱作栽培生理山西省重點試驗室，山西 太谷 030801）

芽苗菜是利用植物種子或營養器官發育成芽、苗、莖的一類新型活體蔬菜[1]。黑豆芽苗菜便是其中一種，也被稱為綠色大豆瓣菜，口感清新，外觀鮮亮，獲得大眾消費的喜愛。同時在萌發過程中可有效降解豆類芽苗菜中抗營養因子，使可溶性糖、維生素等多種生物活性成分含量增加，更利于人機體的消化和吸收[2-3]。

目前，關于芽苗菜的研究還主要集中在光質、光周期等因素對其產量和品質的影響上[4]，以提高其經濟效益為目的居多，而添加外源微量元素現已成為植物營養改良或富集方面的研究熱點[5-9]。世界營養協會規定，成人推薦每日攝入鈣含量應為800 mg，兒童推薦每日攝入量應為700～1 300 mg。但從《中國居民營養與健康狀況檢測》統計的結果來看，我國城市居民每日實際攝入量僅能達到該要求的1/2，隨著兒童年齡的增長，對鈣元素的攝取也存在明顯下降趨勢。銅對人體的造血功能有著重要的影響，人體可耐受的銅用量為0.7 mg/d[10]，但調查發現，各年齡段都未及該標準的90%。因此，加強對食物中鈣元素和銅元素調控等研究刻不容緩。

本研究通過用不同質量濃度的CaCl2和CuSO4溶液分別對黑豆種子進行浸泡處理，分析黑豆芽苗菜生長特性及生理活性物質的變化情況，以期為提升芽苗菜品質提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用晉黑1號由山西省農業科學院選育，挑選色澤光亮、大小一致的種子進行試驗。分別以無水氯化鈣和無水硫酸鈣作為鈣源和銅源，將CaCl2和CuSO4這2 種溶液分別用蒸餾水溶解，配制成0.01、0.05、0.2、0.5和1.0 g/L 5個質量濃度的溶液。

1.2 試驗設計

本試驗于2019 年4 月9 日至4 月18 日在山西農業大學實驗室進行，室內平均溫度為18.52 ℃。選用CaCl2和CuSO42 種溶液分別進行單因素完全隨機區組設計，各設置0（CK）、0.01、0.05、0.2、0.5、1.0 g/L 6個水平，每組50粒種子，設3次重復。

浸泡24 h后取出，換清水浸種數日。將托盤放置于食品級塑料飯盒（25 cm×15 cm×10 cm）中，用透明膠帶在距離飯盒底部1/3高度（約3.5 cm）處固定，在托盤中放置雙層純棉紗布，紗布將托盤完全包住并延伸至飯盒底部，飯盒底部添加適量水分微沒過紗布，紗布浸入水中保證托盤上始終濕潤。種子均勻放于紗布上，且與紗布充分接觸，整粒種子表面積的2/3以上接觸空氣。將整個培養皿置于室溫條件下，定期補充水分，保證每個處理處于相同的試驗環境。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 苗高、發芽率和發芽勢測定 黑豆芽苗菜開始培養后，采用5 點取樣法，每天從各處理中隨機選取15株芽苗菜，使用刻度尺測定其苗高，分別在第3天和第7天記錄數據并計算發芽率和發芽勢。

1.3.2 干鮮質量的測定 培養10 d后，選取5株黑豆芽苗菜，用電子天平稱量其鮮質量，殺青并烘干后記錄其干質量。

1.3.3 生理活性物質的測定 采用紫外吸收法測定可溶性蛋白質含量[11]；采用分光光度計法測定葉綠素a和葉綠素b含量[12]，利用Arnon公式計算得到葉綠素含量。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2016進行數據處理、作圖、制表，使用SPSS 25.0對數據進行方差分析，以及使用最小顯著差異法（LSD）進行多重比較（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度CuSO4和CaCl2溶液對黑豆芽苗菜發芽特性的影響

試驗前期（第1、2 天）CuSO4溶液質量濃度為0.01 g/L 時，芽苗菜苗高較CK 分別增長14.40%和7.22%，而經不同質量濃度CuSO4溶液處理5 d后的黑豆芽苗菜苗高較CK 均受到抑制，抑制率在10.00%～60.30%（圖1）。經質量濃度0.01、0.05 g/L的CaCl2溶液浸種處理后，黑豆芽苗菜苗高較CK分別增加0.85%和2.50%，而質量濃度在0.2、0.5、1.0 g/L 處理的抑制率分別為7.84%、13.72% 和15.58%。

從圖2 可以看出，經不同質量濃度CuSO4溶液浸種處理后，黑豆種子發芽勢為29.00%～66.67%，發芽率為89.33%～98.67%。在0.01、0.5 和1.0 g/L質量濃度下的發芽勢較CK 分別顯著降低13.00%、32.50%和56.50%（P＜0.05），在0.05 和0.2 g/L 質量濃度下與CK 無顯著差異。此外，0.2 g/L 質量濃度下發芽勢較0.5 和1.0 g/L 處理分別顯著提高了25%和51.67%（P＜0.05）。1.0 g/L 處理下的黑豆種子發芽率較其他處理顯著降低了6.95%～9.47%（P＜0.05），其他處理與CK 相比發芽率無顯著差異。

從圖2可以看出，經不同質量濃度CaCl2溶液處理后，黑豆芽苗菜發芽勢為53.33%～66.67%，發芽率為97.33%～99.33%。在1.0 g/L 處理下，黑豆種子發芽勢較CK、0.01、0.05、0.2、0.5 g/L 處理顯著降低13.04%～20.01%（P＜0.05），其他處理間黑豆芽苗菜發芽勢無顯著差異。不同質量濃度CaCl2溶液處理對黑豆種子發芽率均無顯著影響。

2.2 不同質量濃度CaCl2與CuSO4溶液對黑豆芽苗菜干鮮質量的影響

由圖3 可知，不同質量濃度CuSO4溶液浸種處理下，黑豆芽苗菜的鮮質量、干質量間無顯著差異。CaCl2溶液在0.05 g/L 質量濃度下黑豆芽苗菜的鮮質量較0.2、0.5 g/L 處理分別顯著提高了9.29%和12.57%（P＜0.05），0.5 g/L 處理較CK、0.01、0.05、1.0 g/L 處理顯著降低8.57%～12.57%（P＜0.05），0.2、0.5 g/L處理間與CK、0.01、0.05、1.00 g/L處理間均無顯著性差異。當CaCl2溶液在0.2 g/L質量濃度下黑豆芽苗菜干質量較CK 顯著降低了12.28%（P＜0.05），0.05 g/L處理下黑豆芽苗菜的干質量與其他各處理間均無顯著差異。

2.3 不同質量濃度CuSO4和CaCl2溶液對黑豆芽苗菜生理活性物質的影響

隨著CuSO4處理質量濃度的升高，黑豆芽苗菜中可溶性蛋白含量呈現逐漸增加的趨勢，1.0 g/L浸種處理后，較CK、0.01、0.05、0.2、0.5g/L 處理顯著增加9.58%～19.54%（P＜0.05），0.05 g/L 處理與CK、0.01、0.2和0.5 g/L處理間均無顯著差異。不同質量濃度CaCl2溶液處理下的可溶性蛋白含量與CK 間均無顯著差異，且各溶液處理間差異不顯著（圖4）。

由圖5 可知，在0.01 g/LCuSO4溶液處理下葉綠素a 含量較CK 顯著降低32.41%（P＜0.05），且除CK之外，其余各處理間均無顯著差異。0.05 g/L處理下的葉綠素b 含量較CK 顯著提高58.91%（P＜0.05），除CK 之外，其余處理間無顯著差異。葉綠素含量表現為隨CuSO4溶液質量濃度增加呈先增加后降低的趨勢，且在0.05 g/L處理時達到最大，黑豆芽苗菜葉綠素含量較CK、0.2、0.5 和1.0 g/L 處理顯著增加9.38%～22.19%（P＜0.05），0.01、0.05 g/L處理間無顯著差異。

由圖5可知，經CaCl2溶液浸種處理后，在0.2 g/L處理下黑豆芽苗菜葉綠素a含量較CK、0.5和1.0 g/L處理顯著降低了26.94%～45.09%（P＜0.05），除該處理外，其他處理間均無顯著差異。不同CaCl2溶液處理后的葉綠素b 含量與CK 無顯著差異，且各處理間差異也不顯著。葉綠素含量隨CaCl2溶液質量濃度增加表現為先降低后增加的趨勢，在0.2 g/L處理下，黑豆芽苗菜葉綠素含量較CK、0.5 和1.0 g/L 處理顯著降低22.97%～24.31%（P＜0.05），除該處理外，其他處理間均無顯著差異。

3 討論

3.1 不同質量濃度CuSO4溶液浸泡對黑豆芽苗菜生長的影響

Cu2+在適當濃度下可起到富集營養的作用，但含量過高則會導致植物體內代謝紊亂[13]。在趙玉紅等[14]的試驗中，經不同Cu2（+100～500 mg/L）處理后種子苗長均受到抑制，較低Cu2+質量濃度（100～300 mg/L）對紅豆草、白三葉種子的發芽率、發芽勢表現為促進效果，較高質量濃度（400～500 mg/L）表現出強烈的抑制作用，與本試驗研究結果一致。本試驗Cu2+的研究結果與魚小軍等[15]在Cu2+（200～500 mg/L）下對毛苕子、紅三葉和苜蓿等植物種子的發芽率、芽長均呈不同程度降低的影響趨勢相同。不同植物對Cu2+濃度耐受能力不同，抑制植物生長的原因可能是由于過量的Cu2+滲入使細胞膜的強度下降，產生生理毒害作用，進而影響芽苗菜生長[16-17]。

鮮質量體現了植株在自然生長下的狀態，干質量可以反映根的活力、質量以及干物質的積累量。楊麗麗[18]采用不同濃度Cu2（+0.3～1 000 μmol/L）對甜葉菜浸泡后，莖和根的干、鮮質量含量均隨著Cu2+濃度升高而下降。本研究經Cu2+處理后，發現干質量、鮮質量在0.01～1 g/L 范圍內無顯著差異，但呈現下降趨勢，可見黑豆芽苗菜干鮮質量對Cu2+的耐受能力在該范圍內。

3.2 不同質量濃度CaCl2浸泡對黑豆芽苗菜生長的影響

Ca2+可以保證細胞膜結構的穩定性，特別是在環境脅迫條件下，增強植物的抗逆性[19]，但過高濃度的鈣離子會降低植物硼、鋅等微量營養元素的有效性，阻礙磷的代謝進程，從而抑制植物生長[20]。劉志敏[21]選用不同濃度鈣離子對花心蘿卜種子進行處理，發現經最適生長濃度（0～4 mmol/L）浸泡后，高濃度（5～8 mmol/L）對芽苗生長抑制，苗長均呈現低促高抑的趨勢。張毅功等[22]選用不同質量濃度Ca2（+0～160 mg/L）對蘋果苗的鮮質量、干質量進行研究，結果表明，當Ca2+在0～40 mg/L 時，蘋果莖、葉和根的干、鮮質量達到最大，而過高質量濃度（160 mg/L）Ca2+對蘋果各部位均造成生理毒害作用。本試驗CaCl2溶液在較低質量濃度（0.01～0.05 g/L）下促進苗高生長，而0.2～1.0 g/L 下抑制生長。同時，黑豆芽苗菜鮮質量、干質量分別在0.5、0.2 g/L質量濃度顯著下降，而在0.01～0.2 g/L和0.01～0.05 g/L范圍并未有顯著變化，這可能是由于不同植物對Ca2+的敏感性不同導致，后期可適當增大試驗濃度梯度來進一步分析。

3.3 不同質量濃度CuSO4浸泡對黑豆芽苗菜生理活性物質的影響

可溶性蛋白常用作篩選抗性的指標之一，它能提高細胞的保水能力，通常作為衡量是否發生重金屬脅迫的重要標志[23]。王芳洲等[24]將秋茄作為研究對象，探究不同質量濃度（0～45 mg/L）Cu2+對其可溶性蛋白含量變化的影響，結果表明，在0～15 mg/L Cu2+下，可溶性蛋白含量呈現上升趨勢，隨即在30～45 mg/L 下可溶性蛋白含量下降。本試驗在1.0 g/L CuSO4處理下可溶性蛋白顯著增加并未出現下降趨勢，可見黑豆芽苗菜對Cu2+的耐受程度較強。今后可增加試驗濃度梯度，對黑豆芽苗菜可溶性蛋白的耐受峰值做進一步研究。測定葉綠素含量能夠確定植物的光合作用能力，葉綠素含量與施浩威[25]采用Cu2（+0～900 mg/kg）脅迫芳樟葉片處理后葉綠素含量變化趨勢和范圍（0～50 mg/kg）相同。

3.4 不同質量濃度CaCl2浸泡對黑豆芽苗菜生理活性的影響

謝元貴等[26]采用不同濃度（0～50 mmol/L）Ca2+溶液對金銀花葉片浸泡后，結果表明，可溶性蛋白含量均小于CK（0 mmol/L）。而本試驗Ca2+在0.01～1 g/L 范圍內較CK 變化不顯著，可見較低質量濃度Ca2+對黑豆芽苗菜影響不明顯。

PAL等[27]選用不同濃度的Ca2+溶液對花生和亞麻籽粒進行噴施，結果表明，高濃度Ca2+（0.003～0.1 mol/L）或低濃度Ca2（+0～0.003 mol/L）都會使葉綠素含量降低。本試驗中在0.2 g/L CaCl2處理下可溶性蛋白較CK 顯著降低，隨后較之顯著增加，其原因是由于在營養液的離子組成中，Ca2+缺乏可能對特定的代謝過程產生抑制作用，同時鎂作為葉綠素的中心原子[28]，高鈣環境下抑制了鎂的吸收。今后可增加Ca2+濃度進一步研究。

本試驗選用2種溶液對黑豆種子分別浸泡，而未考慮兩者間交互作用的影響，有關黑豆品種，Ca2+、Cu2+濃度及培養條件等因素對各項指標的影響有待進一步探究。

4 結論

當Cu2+質量濃度在1.0 g/L 時黑豆芽苗菜的可溶性蛋白含量顯著增加，但超過該質量濃度葉綠素含量、發芽率、發芽勢顯著降低，且抑制苗高；較低質量濃度（0.01～0.5 g/L）Cu2+浸泡后的黑豆芽苗菜的可溶性蛋白含量間無顯著差異，不同Cu2（+0.01～1 g/L）處理對干鮮質量影響較小，在0.05 g/L處理下芽苗菜苗長影響不大且葉綠素含量顯著增加。

較高質量濃度（1.0 g/L）Ca2+處理后黑豆芽苗菜發芽勢顯著降低，苗高受到抑制，0.2 g/L 處理下葉綠素含量和干質量顯著降低；低質量濃度（0.01～0.05 g/L）CaCl2溶液浸泡對黑豆芽苗菜苗長起到促進作用，且發芽率無顯著差異，但可溶性蛋白含量增加。

綜合來看，Cu2+、Ca2+質量濃度在0.05 g/L 條件下，黑豆芽苗菜生長較好。