HPLC法測定牙膏中厚樸酚與和厚樸酚含量前處理方法的優化

管弋铦 韓和平 李利偉

(重慶登康口腔護理用品股份有限公司，重慶 400025)

引言

厚樸作為中國重點保護的珍稀藥材，其主要活性成分為厚樸酚與和厚樸酚。厚樸酚與和厚樸酚具有抗菌、抗炎、抗病毒和抗氧化等廣譜性生物活性，使厚樸提取物在口腔護理用品中逐漸得到應用[1,2]。目前，關于厚樸酚的含量測定多集中于中藥制劑方面[3,4]，而口腔護理產品中厚樸酚含量的分析鮮有報道，且關于牙膏中厚樸酚與和厚樸酚含量測定的最優前處理條件的研究尚未見報道。

本研究采用高效液相色譜法(HPLC)對牙膏中厚樸酚與和厚樸酚進行前處理方法優化，通過單因素分析法對提取溶劑、甲醇濃度、料液比、振蕩提取時間和超聲時間5個影響因素進行考察，以期提供一種準確度高、檢測效率快的牙膏中厚樸酚與和厚樸酚含量的檢測方法。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

甲醇、乙腈(沃凱，色譜純)，甲酸(川東化工，分析純)，水為實驗室純水機制備的一級水，厚樸酚對照品與和厚樸酚對照品均購自上海源葉生物。

兩年來，公司黨委認真學習貫徹上級黨組織的重要精神和決策部署，以“著力四個自信、聚焦三抓三要、鞏固雙基建設”為工作思路，理直氣壯抓黨建，為生產經營任務的完成提供了強有力的政治和組織保障。2017年以來，公司產量利潤雙創新高，不少集體和個人榮獲昆明市勞動模范、云南省五一勞動獎章、五一巾幗標兵，云南省工人先鋒號、上級公司優秀黨員，優秀黨務工作者、先進基層黨組織等榮譽。

1.2 儀器

高效液相色譜儀(1290 Infinity Ⅱ，安捷倫)；Welch Ultimate XB-C18色譜柱( 4.6mm×250mm，5μm) 、電子天平 ( ME204，梅特勒托利多) 、超聲清洗器(GT-SONIC-D9，固特) 、超純水系統( 1810A，摩爾)。

2 實驗方法與結果

稱取1g(精確至0.0001g)牙膏樣品于20mL玻璃取樣瓶中，加玻璃珠數顆，用移液管分別按料液比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15加入4、6、8、10、15mL 90%甲醇，在轉速1800r/min條件下振蕩提取15min，超聲30min，冷卻至室溫后提取液過0.22μm有機相濾膜，濾液上機檢測，結果見表4。當料液比達到1∶10后結果變化較小。與1∶15相比，1∶10的料液比經濟效益更高，故綜合考慮選擇料液比為1∶10。

2.1 液相色譜條件

建筑給排水工程施工結束后，應及時對管道的清潔性、保溫性以及防腐性進行檢查，防止給排水工程出現因高溫及腐蝕等因素影響管道正常運行。同時，在整個安裝工程結束之后，還應該對排水系統進行適當的調整和驗收，檢測整個安裝質量是否合格。

2.2 提取溶劑的篩選

稱取1g(精確至0.0001g)牙膏樣品于20mL玻璃取樣瓶中，加玻璃珠數顆，用移液管加入10mL 90%甲醇，在轉速1800r/min條件下分別振蕩提取2min、5min、8min、10min、15min、20min，超聲30min，冷卻至室溫后提取液過0.22μm有機相濾膜，濾液上機檢測。如表3所示，振蕩提取15min以上，樣品分散徹底、提取效果較好，與20min相比，振蕩15min效率更高。因此，綜合考量選取振蕩提取時間為15min。

表1 不同提取溶劑對厚樸酚和和厚樸酚提取的比較

2.3 甲醇濃度的篩選

稱取1g(精確至0.0001g)牙膏樣品于20mL玻璃取樣瓶中，加玻璃珠數顆，用移液管加入10mL 90%甲醇，在轉速1800r/min條件下振蕩提取15min，分別超聲0min、10min、20min、30min、40min、60min，冷卻至室溫后提取液過0.22μm有機相濾膜，濾液上機檢測，其結果如表5所示。當超聲時間大于20min后提取效果提升不明顯，但預實驗中某些特殊牙膏提取時，超聲時間不足會造成分散不充分，綜合考量選擇超聲時間為30min。

表2 甲醇濃度對厚樸酚與和厚樸酚提取的影響

2.4 振蕩提取時間的篩選

稱取1g(精確至0.0001g)牙膏樣品于20mL玻璃取樣瓶中，加玻璃珠數顆，用移液管分別加入10mL甲醇、乙醇、乙腈及水，在轉速1800r/min條件下常溫振蕩提取15min，超聲30min，冷卻至室溫后提取液過0.22μm有機相濾膜，濾液上機檢測。不同提取溶劑對牙膏中厚樸酚與和厚樸酚提取效果的影響結果如表1所示，提取效果分別是甲醇>乙醇>水>乙腈。

(2)冷源中有2臺吸收式溴化鋰機組，蒸汽來源為3臺3.9/h的燃油蒸汽鍋爐，和直燃型溴化鋰制冷機組相比，鍋爐轉換效率、熱力管網兩部分損失增大，整個冷源系統的效率明顯下降；

表3 振蕩提取時間對厚樸酚與和厚樸酚提取的影響

2.5 料液比的篩選

本研究采用單因素分析法考察提取溶劑、甲醇濃度、料液比 、振蕩提取時間和超聲時間5個因素對厚樸酚與和厚樸酚含量檢測的影響，從而選出最優前處理條件。由于上述5因素分別來源于溶劑、時間、設備，彼此互不相容，設備之間原理不同且獨立工作，不存在交互作用，可用單因素實驗法篩選，以確定前處理最優方法。

依據預實驗結果確定了液相色譜分析條件為Welch Ultimate XB-C18色譜柱( 4.6mm×250mm，5μm)，流動相為乙腈∶0.1 %甲酸溶液=52∶48(V/V)；流速1.0mL/min；柱溫30℃；檢測波長為294nm，參比波長450nm；進樣體積為10μL。在此條件下空白對照樣品、對照品和含厚樸酚與和厚樸酚牙膏的HPLC圖譜如圖1所示。

表4 不同料液比對厚樸酚與和厚樸酚提取的比較

2.6 超聲時間的篩選

稱取1g(精確至0.0001g)牙膏樣品于20mL玻璃取樣瓶中，加玻璃珠數顆，用移液管分別加入10mL 50%、70%、90%、100%濃度的甲醇，在轉速1800r/min條件下常溫振蕩提取15min，超聲30min，冷卻至室溫后提取液過0.22μm有機相濾膜，濾液上機檢測，結果如表2所示。當用50%甲醇提取時，提取液難以過膜，100%甲醇提取時牙膏易板結，難以分散。以90%的甲醇提取時，牙膏更易分散，過膜時透過性相對較好，且提取率與100%甲醇相當。楊培等[5]研究發現，當甲醇濃度在10%～90%時，厚樸酚與和厚樸酚的提取率隨甲醇濃度的增加而增加，而90%與100%甲醇提取結果無顯著差異，與本研究結果一致。因此，綜合考慮，選擇90%甲醇作為提取厚樸酚與和厚樸酚的最佳濃度。

從像控點的布設方案可以看出，方案一與方案二的區別在于，方案一在測區周邊未進行像控點加密，方案二在測區周邊做了像控點加密，兩種方案在測區內的布設方法是相同的。在測區周邊均進行加密布點的情況下，設計了方案三、方案四，這兩種方案與方案二的區別在于，在方案二的基礎上，兩個方案在測區內，旁向方向的像控點間隔航線數在增加。

表5 超聲時間對厚樸酚與和厚樸酚提取的影響

2.7 確定的提取條件

稱取牙膏1g(精確至0.0001g)于20mL玻璃樣品瓶中，加玻璃珠數枚，再以移液管加10mL 90%甲醇，以多聯漩渦混勻器于1800r/min轉速下振蕩提取15min，然后超聲30min，冷卻至室溫后提取液用0.22μm有機相膜過濾，濾液待測。

2.8 優選前處理條件的精密度考察

取同一批牙膏樣品6份，按照優選前處理條件處理后進行色譜分析，記錄厚樸酚與和厚樸酚的含量，并計算其RSD值，結果如表6所示。由表6可知，優選的前處理條件方法精密度高，檢測結果穩定。

表6方法精密度試驗

3 結論

本研究考察了采用高效液相色譜法測定牙膏中厚樸酚與和厚樸酚含量時，前處理過程中提取溶劑、甲醇濃度、料液比、振蕩提取時間和超聲時間等5個因素對提取結果的影響。根據單因素試驗的結果優選出高效液相色譜法測定牙膏中厚樸酚與和厚樸酚含量的最優前處理條件為：稱取牙膏1g，加玻璃珠數枚，再以移液管加10mL 90%甲醇，以多聯漩渦混勻器于轉速1800r/min條件下振蕩提取15min，超聲處理30min。方法精密度試驗結果表明，篩選出的最優前處理條件方法精密度高，有利于提高檢測結果的準確性。