新型四倍體水稻創制及其雜種優勢利用研究進展

劉向東 吳錦文 SHAHID Muhammad Qasim

（1. 華南農業大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣州 510642；2. 廣東省植物分子育種重點實驗室，廣州 510642；3. 華南農業大學農學院，廣州 510642）

多倍體植物在自然界中廣泛存在。據不完全統計，自然界中50%-70%的被子植物，包括許多重要的農作物曾發生一次或多次多倍化［1-2］。多倍體植物具有生長健壯、抗逆性強、果實大和營養成分高等優點，創制和利用多倍體是植物育種的重要途徑之一［3-6］。由我國創制并在青藏高原大面積種植的八倍體小黑麥就是多倍體育種的一個成功案例。

水稻是世界上最主要的糧食作物之一。目前生產上大面積推廣的水稻是二倍體，尚沒有多倍體推廣應用［3］。已報道的多倍體水稻主要是指由二倍體水稻通過染色體加倍而形成的同源四倍體水稻［7-8］。與其他多倍體植物一樣，同源四倍體水稻表現為籽粒增大、蛋白質含量提高［9］、耐鹽性和抗性增強［10-13］等特點。此外，同源四倍體水稻雜種F1具有明顯的雜種優勢，其后代可產生與二倍體不同的基因重組，可為創造稀有材料及優良新品種提供一種新途徑［14-16］。因此，開展多倍體水稻研究對于開辟水稻育種新途徑及其相關基礎研究具有重要意義［2-5，14-21］。

1 同源四倍體水稻研究概況

同源四倍體水稻研究可追溯到20世紀30年代。日本于1933年最早報道了自然形成的同源四倍體水稻，次年又通過人工加倍二倍體水稻獲得了同源四倍體水稻。1950-1960年期間，日本科學家開展了同源四倍體水稻及其雜種細胞的遺傳學研究并取得了一些有價值的結果，發現雜種F1育性提高，染色體配對異常率比親本低［7］。但1960年以后至今，國外（包括日本在內）有關同源四倍體水稻的研究報道卻不多。

我國自1951年開展四倍體水稻的研究，1956年報道誘導出同源四倍體水稻，并研究發現同源四倍體水稻育性普遍偏低，但秈型和粳型同源四倍體水稻雜交F1育性明顯提高，可能具有應用前景［8］。20世紀80-90年代期間，我國科學家通過雜交育種結合花藥培養技術，選育出同源四倍體水稻優良無性系并在生產上試種，其中有些品系產量超過二倍體水稻［9］。20世紀90年代以后，國內陸續有多家單位開展多倍體水稻研究，并取得重要進展，主要表現為以下3方面：

（1）建立了高效的秋水仙堿誘導加倍技術，創制出一大批不同類型攜帶優異基因的同源四倍體水稻材料，包括攜帶廣親和基因、質核互作和光溫敏核雄性不育基因、無芒基因的同源四倍體水稻，以及攜帶“秈粳雜種F1花粉不育”基因的同源四倍體水稻近等基因系等［5，22-23］。培育出同源四倍體水稻光溫敏核雄性不育系［24］，組配出同源四倍體水稻強優組合［25-26］。涂升斌等［25］報道建立了水稻同源四倍體的雜種優勢利用技術體系，選育出同源四倍體水稻雄性不育系近千份、保持系和恢復系各20多份，組配出T462A×T4509強優組合，成功地通過三系配套實現了四倍體水稻雜種優勢利用。

（2）闡明同源四倍體水稻低育性的細胞學和分子遺傳學原因。研究發現，同源四倍體水稻花粉母細胞減數分裂期間染色體行為普遍存在異常現象，花粉和胚囊發育過程、受精、胚胎和胚乳發育過程中均存在不同程度的異常現象，這些異常都可能是引起同源四倍體水稻育性偏低的細胞學原因［27-33］。在分子遺傳層面，與二倍體水稻原種比較，同源四倍體水稻花粉和胚囊發育期間育性相關基因存在異常表達、甲基化程度改變和非編碼RNA（包括lncRNA和miRNA等）的異常表達等［29-30，34-37］。比如，同源四倍體水稻減數分裂相關的基因OsDMC1、OsMS2、PAIR2和OsMTOPVIB等，以及小孢子發育期間糖代謝相關基因OsSUT5和OsMST8等均表現下調表達［23，30］。Wu 等［22］發現同源四倍體水稻雜種花粉不育基因多座位（SaiSaiSajSaj、SbiSbiSbjSbj和SciSciScjScj）互作在多倍性的遺傳背景下具有類似“上位性”的加強效應，可引起包括RAD51和泛素E3連接酶OsPUB73等基因在內的減數分裂期相關基因的表達顯著下調，使花粉母細胞在減數分裂期就出現明顯異常，進一步引起小孢子發育異常，最終使雜種花粉高度不育，較好地解釋了同源四倍體水稻雜種育性偏低的分子遺傳原因。值得一提的是，花粉育性“中性基因”可以克服多座位互作引起的不育性，為同源四倍體水稻亞種間的雜種優勢利用提供了可能［23，28，38］。此外，Wu 等［15］發現同源四倍體水稻雜種后代發生了廣泛的、個性化的部分同源交換（HE），引起部分同源染色體片段的拷貝數變化，進而影響已知功能基因及其互作，使多倍體群體水平表型產生多樣性，增強其進化潛力。

（3）創制（培育）了高育性四倍體水稻新材料。我國科學家為了解決同源四倍體水稻育性偏低的瓶頸問題，經過多年努力創制出高育性的四倍體水稻新材料［21，39-40］。其中，研究較多的分為兩類：一類是“減數分裂穩定多倍體水稻”（polyploid meiosis stability，PMeS，以下簡稱“PMeS 水稻”）［5，39，41-42］。PMeS水稻的育性超過65%，其與同源四倍體水稻雜交，F1結實率超過70%；經進一步改良后育性可達到80%以上［5，39］。擬南芥同源基因MND1在PMeS水稻減數分裂過程中起了重要作用［43］。第二類便是新型四倍體水稻（neo-tetraploid rice）［17，40，44-45］。

2 新型四倍體水稻創制過程及主要特點

新型四倍體水稻是通過同源四倍體水稻Jackson-4x（美國稻Jackson加倍獲得同源四倍體水稻，由中國科學院華南植物園黎垣慶提供）與96025（中國農科院作物所選育，趙開軍提供）進行雜交，并經過多年多代選育而成［17］。其中華多1號和華多2號兩個品系分別于2009年和2010年育成，2016年獲得國家植物新品種權［17］。由于該多倍體水稻既不同于由二倍體水稻直接加倍獲得的同源四倍體水稻，也不同于異源四倍體水稻。所以，我們參照新型四倍體擬南芥（neo-tetraploid Arabidopsis）的表述［46］，于 2017年首次以“neo-tetraploid rice”（中文“新型四倍體水稻”）在國際學術刊物上報道了新型四倍體水稻華多3號［40］。此后，又報道了 華 多 1 號［47］、 華 多 2 號［17，45］、 以 及 華 多 4-8號［44，48］。其中，華多8號是一份長穗型并具有廣親和基因的新型四倍體水稻［44］。新型四倍體水稻主要有以下5方面特點：

（1）育性高。新型四倍體水稻育性高達80%［17，23，40，44-45］，而同源四倍體水稻的育性一般在0-70%之間波動，參數在50%以下。

（2）新型四倍體水稻攜帶多種優異基因，包括廣親和基因、花粉育性“中性基因”和高育性基因等，可以作為多倍體水稻育種的骨干親本［23，44］。

（3）新型四倍體水稻基因組中存在豐富的DNA變異。其中，最有特點的是兩類，一類是非親本型的變異基因（non-parental genes），也就是在雜交的高代材料中，產生雙親都沒有的變異位點（基因）。例如，在13份新型四倍體水稻中共檢測到222個非親本型的變異基因［45］；第二類是全新等位變異基因，即存在與二倍體水稻和同源四倍體水稻完全不同的新等位變異，如熱激蛋白新等位變異基因“HSP101-1”等［49］。

（4）新型四倍體水稻類型獨特。Yu等［49］通過PCA（principal components analysis）、系統發育和ADMIXTURE的群體結構分析，發現新型四倍體水稻具有與同源四倍體水稻和二倍體水稻不同的變異基因，分類屬于獨立的亞群，偏粳但與典型粳稻分屬不同的亞群。

（5）新型四倍體水稻雜種優勢強且可保持多代。新型四倍體水稻與秈型同源四倍體水稻雜交F1育性高達90%，產量超親優勢十分明顯，部分雜交組合的超親優勢大于140%，產量可超過二倍體水稻推廣品種黃華占。新型四倍體水稻雜種后代（F2-F5）仍可以保持高育性和較高的產量優勢［44］，顯示出該四倍體水稻在雜種優勢利用，特別是多代優勢利用上具有廣闊的應用前景。

3 新型四倍體水稻雜種優勢及其分子遺傳研究

新型四倍體水稻的雜種F1不僅具有生物學優勢，而且還表現出明顯的產量優勢。自2016年以來，本團隊利用新型四倍體水稻與不同類型四倍體水稻雜交并組配了超過70個組合，發現雜種F1優勢明顯，其中包括單株實粒數、結實率和單株產量的中親優勢均達到顯著水平，超親優勢也十分明顯。統計其中53個組合的雜種優勢發現，實粒數、結實率和單株產量中親優勢平均值分別為84.41%、32.94%和106.58%；超親優勢平均值分別為59.27%、13.83%和75.82%［40，44］。新型四倍體水稻與秈型同源四倍體水稻雜交F1的產量優勢顯著高于與粳型同源四倍體水稻雜交F1的優勢，這可能與新型四倍體水稻偏粳型有關。其中，4001-4x×華多8號和Bengal-4x×華多8號兩個組合的理論產量均超過二倍體水稻推廣品種，應用潛力較大［44-45］。利用同源四倍體水稻增城絲苗-4x與新型四倍體水稻華多8號組配的雜種F1，其粒型和外觀均偏向絲苗米，表現出籽粒細長、米粒外觀透明，有望培育出優質四倍體雜交稻。

為揭示新型四倍體水稻雜種優勢的分子遺傳機理，本團隊先后利用4個雜種F1及其雙親進行轉錄組研究，發現新型四倍體水稻雜種優勢的產生主要涉及 6 類基因的差異表達［23，40，44］：

（1）與育性相關基因的上調表達，包括花粉發育相關基因，如DPW和CYP703A3基因等。這些基因的上調表達可能是雜種F1高育性的原因之一［23，40，44］。

（2）能量物質合成相關基因的上調表達，包括淀粉合成酶和糖代謝基因等。如MUT5和MTS8等基因在雜種F1高表達，OsBEIIb和OsSSIIIa在雜種F1開花后 3 d 的籽粒中表達上調［23，44］。

（3）編碼NBS-LRR抗病蛋白或LRR受體樣蛋白激酶基因。比如在（T485×H8）F1和（H1×H8）F1兩個組合中，共檢測到714個差異表達的已知基因，其中涉及抗性或耐受相關基因為66個［44］。

（4）轉錄因子（TF）等。以上兩個組合共檢測到76個特異表達的 TF［44］。

（5）與產量相關的QTL。以上兩個組合共檢測到109個差異表達基因位于7個產量性狀相關QTL區間［44］。

（6）與雜種優勢相關的已知基因等。以上兩個組合檢測到一些與雜種優勢相關的差異基因，包括NAL1、Gn1a、qGW8、OsGA20ox1、Ghd8、GW6a、LP1 和 EUI1、i-sd-1（t）、sd1、OsGA20ox2 和 qSD1-2（dee-geo-woo gen dwarf）、DEP1、DN1、qPE9-1 和qNGR9（密穗）等，說明與二倍體雜交稻雜種優勢相關的基因很可能在四倍體水稻雜種優勢中也發揮作用［44］。

此外，研究還發現新型四倍體水稻雜種的差異表達基因具有特異性，即存在與二倍體雜交稻不同的差異表達基因。新型四倍體水稻的（黃華占-4x×華多8號）F1和（華多1號×華多8號）F1兩個組合中，發現其中差異表達的21個NBS-LRR基因和71個轉錄因子（TF）與超級雜交水稻LYP9（兩優培九）的不同。與LYP9的進行比較，其中57個QTL是不同的［44］，包括4個與結實有關（AQGH011、AQGH028、AQCB017和 AQED063）、15個 與 生 物產量有關、14個與穗數有關、24個與穗粒數有關的QTL。有趣的是，比較4個不同新型四倍體水稻的雜種F1，發現其中48個差異基因位于產量相關QTL區間，包括2個與千粒重相關（AQAI071和CQB16）、3個與結實相關（AQGH011、AQGH028和 CQB14）、13個與穗數相關的 QTL（AQCY027、AQGM014、CQK1、CQK2、CQK18、CQK19、CQAS135、CQJ1、CQJ2、CQJ4、CQJ9、AQFF055和AQFF061）；此外，新型四倍體水稻雜種優勢的產生還可能涉及“非加性表達的基因”（nonadditiveexpressed genes）的表達［44］。

上述研究結果說明，新型四倍體水稻雜種優勢的分子遺傳機理較為復雜，與二倍體水稻具有相似之處，如雜種優勢相關的顯性基因聚集等；但也存在不同之處，如檢測到特異的抗性、轉錄因子和QTL等。

4 挑戰與展望

中國水稻雜種優勢利用研究在世界上處于領先地位，為世界特別是我國糧食安全做出了巨大貢獻。但應該指出，二倍體水稻育種也面臨巨大的挑戰，這主要是因為全球面臨兩大問題：一是人口不斷增加帶來的糧食安全問題。據預測，到2050年全球糧食需求比現在將增加50%［4］。所以，包括水稻在內的主要糧食作物的單產亟待提高；二是全球氣候變暖、極端溫度、干旱和洪澇頻發、土壤退化、病蟲害爆發等因素嚴重威脅作物生長和收獲。為此，需要培育抗性更強的作物。現有二倍體水稻基因組較小，基因組緩沖能力有限，能否適應未來可能出現的劇烈環境變化還難以預測。為了應對以上問題，科學家提出了兩條解決途徑：一是栽培稻的多倍化，培育四倍體水稻，利用四倍體水稻的高抗性和強雜種優勢；二是利用分子生物學技術加速異源四倍體野生稻的馴化，創制水稻新物種［4］。

新型四倍體水稻作為目前高育性的多倍體水稻之一，其雜種具有明顯的優勢，而且可以保持多代，有望在多倍體水稻育種上取得重大突破。為了在生產上利用新型四倍體水稻的雜種優勢，需要加快解決以下3個瓶頸：

（1）創制高效不育系。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除新型四倍體水稻的TMS5基因，高效選育四倍體水稻溫敏不育系。

（2）培育強恢復系。由于已報道發現了一系列與四倍體水稻雜種優勢相關的基因，因此可利用水稻的海量重測序數據進行全基因組篩選，選出具有雜種優勢相關基因優異等位型的水稻品種（系），直接加倍獲得強恢復系與新型四倍體水稻不育系雜交，有望組配強優組合。

（3）解決四倍體水稻種子的成本問題。二倍體水稻只能利用雜種F1的優勢而無法利用F2及其后代的優勢，所以需要年年制種，制種成本較高。而四倍體水稻每個基因組包含4條染色體，每個位點有4個等位基因。從理論上講，其雜合狀態可以持續多代，而且不同座位的雜合狀態可以保持更多世代。這為四倍體水稻的多代雜種優勢利用提供了理論基礎。有研究已初步證實四倍體水稻雜種自交后代的優勢至少可以保持5代，即一次制種可以利用5代，使制種成本顯著降低。

目前，本團隊已初步解決以上3個難題，有望在不遠的將來取得突破，實現新型四倍體水稻的成功利用，為促進水稻多倍體育種邁上新臺階作出貢獻。

致謝：謹以此文紀念盧永根院士在稻種資源保護與創新研究上的杰出貢獻。同時感謝本室其他成員及國內同行專家多年來的大力支持。由于我國有關同源四倍體水稻研究文獻很多，所以，本文只列上部分文獻，特此說明。