miR-21、ILK 及Bax 蛋白在CIN 中的表達及臨床意義

董芮 趙琳 董琴 管業(yè)秋 徐愛芳

宮頸癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一，有著較高的病死率［1］。近些年來該病患病率持續(xù)升高且趨于年輕化，對社會造成沉重的壓力［2］。據(jù)報道，宮頸癌的發(fā)生與宮頸上皮內(nèi)瘤變（Cervical Intraepithelial Neoplasia，CIN）有一定關(guān)聯(lián)［3］。CIN主要由于人類乳頭狀瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）對女性生殖器的持續(xù)性感染外所致。目前，醫(yī)學(xué)研究員致力于尋找更有效的指標(biāo)對CIN進行早期診斷，以緩解宮頸浸潤速度［4］。嚴(yán)曉春等學(xué)者［5］研究顯示內(nèi)源性非編碼RNA 對腫瘤細(xì)胞的增殖有一定刺激作用。隨著對腫瘤細(xì)胞的深入研究，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為促凋亡基因與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有明顯相關(guān)性［6］。綜合上述觀點，本文推測促凋亡基因、內(nèi)源性非編碼RNA 對CIN 病變細(xì)胞死亡有一定影響。故本文展開對微小RNA-21（microRNA-21，miR-21）、整合素連接激酶（Integrin-Linked Kinase，ILK）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 Assaciated X protein，Bax）三種相關(guān)因子進行研究，探尋其表達水平對CIN 的影響。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2020 年1 月至2022 年10 月蘇州科技城醫(yī)院收診并治療的63 例宮頸上皮內(nèi)瘤變患者納入CIN組進行研究，選擇同期84 名健康志愿者納入對照組進行研究。所有研究對象均為女性，其中CIN 組平均年齡（46.72±5.13）歲；對照組平均年齡（47.03±5.10）歲。兩組患者年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），有可比性。

CIN 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《子宮頸上皮內(nèi)瘤變或原位腺癌的處理》［7］標(biāo)準(zhǔn)；②既往無化療史及大型手術(shù)治療史；排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有CC 治療史患者；②未簽署知情同意書患者；③合并其他腫瘤患者。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會通過，受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

采集兩組受試者宮頸組織，對宮頸表面進行清潔后將宮頸窺探器置入宮頸表面旋轉(zhuǎn)，并將宮頸刷上宮頸組織制成病理標(biāo)本；采集兩組受試者外周靜脈血5 mL，對血液樣本進離心處理（2 800 r/min 離心半徑8 cm，10 min）后取血漿保存至-60℃環(huán)境中，采用RNA 試劑盒（規(guī)格：MA-6000，蘇州雅睿生物技術(shù)有限公司，國械注準(zhǔn)20173401410）對血漿中總RNA 進行提取，并通過反轉(zhuǎn)錄試劑（規(guī)格：48T，深圳市晉百慧生物有限公司，國械注準(zhǔn)20183400108）制成cDNA，再由熒光定量PCR 測定儀（型號：RTQ-960，艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司，國械注準(zhǔn)20134524139）在高溫下進行變性、循環(huán)等操作，最終用2-ΔΔCT計算機體組織的miR-21 的相對表達量。聯(lián)合ILK 試劑盒（規(guī)格；96T，上海晶抗生物工程有限公司，國械注準(zhǔn)20167438241）、Bax 試劑盒（規(guī)格：96T，廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司，粵穗械備20191982 號）及細(xì)胞色素氧化酶二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒［規(guī)格：2×3 mL，羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司，國械備20161582 號］，根據(jù)試劑盒說明書對宮頸組織進行常規(guī)免疫組化檢驗，用PBS 緩沖液代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。所有切片均在相同條件下進行。

結(jié)果判定［8］：ILK 及Bax 陽性表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒。在高倍顯微鏡下隨機對5 個視野進行查看，單個視野中選200 個細(xì)胞進行計數(shù)，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比對結(jié)果進行計分，0 分：細(xì)胞占比＜5%，1 分：5～25%，2 分：26～50%，3 分：51%～75%，4 分：＞75%；再根據(jù)陽性細(xì)胞著色程度進行計分，1 分：呈淡黃色，2 分：呈黃色，3 分：呈黃棕色。最終陽性強度為陽性細(xì)胞所占百分計分與陽性細(xì)胞著色程度的乘積，陰性：-，0 分，弱陽性：+，1～4 分，陽性：++，5～12 分，強陽性：+++，＞12 分，采用≥++率表示陽性表達率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料采用（±s）的形式表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-21 表達比較

CIN 組miR-21相對表達量（2.57±0.82）高于對照組（1.03±0.14），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.906，P＜0.05）。

2.2 兩組Bax 表達比較

CIN 組Bax 蛋白陽性率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 Bax 蛋白在各組宮頸組織中的表達［n（%）］Table 1 Expression of Bax protein in cervical tissues of each group［n（%）］

2.3 兩組ILK 表達比較

CIN 組ILK 陽性率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 ILK 在各組宮頸組織中的表達［n（%）］Table 2 Expression of ILK in cervical tissues of each group［n（%）］

2.4 宮頸組織中miR-21、ILK 及Bax 蛋白陽性表達與病理特征的關(guān)系

不同年齡階段、不同組織類型的miR-21、Bax蛋白、ILK 陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而CIN 分級越高，宮頸組織中ILK 陽性率高，Bax 陽性率越低，miR-21 相對量越多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 宮頸組織中miR-21、ILK 及Bax 蛋白水平表達與病理特征的關(guān)系［n（%），（±s）］Table 3 Relationship between expression of miR-21，ILK and Bax proteins and pathological features in cervical tissues［n（%），（±s）］

表3 宮頸組織中miR-21、ILK 及Bax 蛋白水平表達與病理特征的關(guān)系［n（%），（±s）］Table 3 Relationship between expression of miR-21，ILK and Bax proteins and pathological features in cervical tissues［n（%），（±s）］

組別年齡n ILK Bax 蛋白陽性11（29.73）9（34.62）4（13.79）16（47.06）17（31.48）3（37.50）χ2χ2χ2 P 值0.6820.033＜40≥40Ⅰ～Ⅱ級Ⅲ級P 值0.8560.642 0.168 P 值0.523 CIN 分級0.005 7.99311.5330.0012.3560.027組織類型 高級別鱗狀上皮低級別鱗狀上皮37 26 29 34 54 8 0.1160.734陽性25（67.57）17（65.38）13（44.83）29（85.29）38（70.37）4（50.00）1.3230.690 miR-21相對表達量4.37±1.24 4.58±1.33 4.03±1.16 4.89±1.74 4.12±1.20 4.48±1.620.7560.452

3 討論

近些年來，宮頸癌患病人群呈上升趨勢，研究學(xué)者力求尋找更有效的治療方案，進一步對宮頸癌相關(guān)病理機制及其癌前病變進展情況進行探究。研究發(fā)現(xiàn)CIN 病變細(xì)胞的分化、凋亡與細(xì)胞間信息傳遞有密切關(guān)系［9］。因而阻斷病變細(xì)胞信號傳導(dǎo)并誘導(dǎo)病變細(xì)胞凋亡成為了CIN 治療的新方向。

大量研究顯示，miR-21 能促進腫瘤細(xì)胞的增殖和分化，對腫瘤細(xì)胞的凋亡有抑制作用［10］。韓寧［11］對154 例宮頸癌患者進行研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中miR-21 的相對表達量較高。而許娟秀［12］對CIN 患者深入探究后提出，miR-21 在CIN 患者等宮頸組織中也有較高的表達。上述研究與本文對CIN 患者探究后得出的結(jié)果一致。由此猜測miR-21 可能通過識別病變細(xì)胞的脆性定位點，削弱mRNA 對病變細(xì)胞基因的調(diào)控作用，進而抑制病變細(xì)胞的凋亡，加速CIN 的發(fā)展。同時李允利等［13］在研究中提出miR-21 可能具有致癌基因的功效。但目前對于該論點的相關(guān)文獻較少，需對此進一步研究證實。

王秀靈等［14］通過上調(diào)腫瘤患者體內(nèi)Bax 蛋白，發(fā)現(xiàn)其化療效果得到有效提高，分析推測Bax蛋白增加了機體對化療的敏感度。本文同樣對Bax 蛋白深入研究，結(jié)果顯示CIN 組Bax 蛋白陽性率顯著低于對照組，此結(jié)果與孔佑虔［15］一致。Bax蛋白是一種促進細(xì)胞凋亡的因子，在機體內(nèi)以二聚體的形式誘導(dǎo)病變細(xì)胞死亡，同時抑制B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的抗凋亡作用，推進病變細(xì)胞的凋亡，抑制癌前病變的發(fā)展，曾永蕾等［16］也曾推測Bax 蛋白可逐漸發(fā)展成為癌變的預(yù)測因子。

ILK 因子是一種新型信號導(dǎo)轉(zhuǎn)因子，能提高激活蛋白（Activator Protein 1，AP-1）的活性，進而對基因表達進行調(diào)控。ILK 在CIN 患者體內(nèi)能有效抑制病變細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)，進而增強病變細(xì)胞的侵襲能力，推動宮頸組織的惡化，致使CIN 向浸潤癌發(fā)展。Godínez 等［17］科研學(xué)者通過將ILK 陽性細(xì)胞植入實驗鼠體內(nèi)，觀察到實驗鼠隨著植入細(xì)胞的生長，其正常細(xì)胞逐漸發(fā)展成為惡性腫瘤細(xì)胞。而本文對ILK 展開研究，結(jié)果顯示CIN 組患者宮頸組織中ILK 呈現(xiàn)高表達，與吳雪艷等［18］研究結(jié)果相符。進一步對miR-21、ILK、Bax 研究可知，不同年齡階段、不同組織類型的miR-21、Bax 蛋白、ILK 陽性表達率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而CIN 分級越高，宮頸組織中ILK 陽性率高，Bax 陽性率越低，miR-21 相對量越多。但此結(jié)論與李曉丹［19］研究得出的觀點存在較大差異，推測其可能原因為本研究樣本不足，導(dǎo)致組間對比不充分，同時本文未對miR-21、ILK、Bax 蛋白因子間相互影響進行分析，導(dǎo)致研究結(jié)果受到干擾，因此需再深入研究證實。

綜上，miR-21、ILK 在CIN 患者宮頸組織中呈現(xiàn)高表達，Bax 蛋白呈現(xiàn)低表達，而miR-21、ILK、Bax 蛋白水平與CIN 病變細(xì)胞的凋亡有密切關(guān)聯(lián)。