2 例3M 綜合征產前診斷的病例報道及文獻復習

王逾男 汪安石 熊盈 曾玉坤 余麗華 何天文★

3M 綜合征是一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病，發病率不明，目前全世界僅100 余例報道。其臨床表現為產前和產后生長發育遲緩、特殊面容、頭圍增大和骨骼發育異常等，而智力水平和內分泌功能通常正常，男性常伴有性腺功能減退，偶有尿道下裂［1］。1975 年，三位遺傳學家米勒、麥庫西克和馬爾沃首次發現并報道了本病，故其以三位遺傳學家名字的首字母命名［2］。根據2019 年修訂的遺傳性骨骼疾病分類，3M 綜合征被歸類為細長骨發育不良組，其典型的骨骼改變為管狀骨，椎體縮短和骨齡延遲［3］。3M 綜合征的生長障礙大多是由致病基因CCDC8、OBSL1、CUL7突變而引起的，占比分別為8%、23%、69%［4］。本病大多數于兒童期或成年后診斷，若無先證者，極難在產前明確診斷。本研究分析了兩例宮內表現為嚴重宮內生長發育遲緩的3M 綜合征胎兒的產前超聲表現及產前診斷結果，以期豐富中國人群宮內生長發育遲緩的遺傳信息。提高大家對3M綜合征宮內表現的認識，有助于其早期宮內診斷。

1 研究對象與方法

1.1 病例資料

病例1，孕婦鄒××，29 歲。孕18 周因“NT 增厚4.2 mm，超聲提示胎兒股骨徑小于孕周3 周”轉診到本院。G2P1A0，2015 年孕37 周因胎兒四肢短小，胸廓狹窄，雙肺發育不良，羊水過少外院引產1 次；夫妻雙方正常身高。孕婦于18 周接受了羊水染色體核型分析、染色體微陣列基因芯片檢測（chromosomal microarray，CMA）及FGFR3 基因測序檢查，結果均未見異常。孕婦于孕23+6周行Ⅲ級超聲檢查，結果提示胎兒四肢長骨明顯小于孕周（4～5 周），為進一步明確病因，擬采用高通量測序方法針對孕婦本人、孕婦丈夫以及胎兒進行醫學外顯子組序列分析。胎兒孕期不同孕周生長徑線情況。見表1。

表1 病例1 胎兒不同孕周生長徑線情況Table 1 Growth diameter at different gestational weeks of Fetus 1

病例2，孕婦林××，34 歲，孕29+周因“胎兒四肢長骨明顯小于孕周5～7 周”轉診到本院。孕期NT 檢查正常范圍。外院已行介入性產前診斷，檢查項目包括羊水染色體核型分析、CMA 及FGFR3基因測序檢查，結果均未見異常。孕產史無特殊。為進一步明確病因，擬采用高通量測序方法針對孕婦本人、孕婦丈夫以及胎兒進行醫學外顯子組序列分析。胎兒孕期不同孕周生長徑線情況見表2。

表2 病例2 胎兒不同孕周生長徑線情況Table 2 Growth diameter at different gestational weeks of Fetus 2

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

采用血液基因組DNA 提取試劑盒（廈門致善生物科技股份有限公司）提取外周血基因組DNA；利用柱提法對產前診斷標本（羊水/臍血）進行基因組DNA 提?。≦iamp DNA Blood Mini Kit）。提取完成后，用NanoDrop 2000 超微量分光光度計DNA 進行純度和濃度的測定，合格DNA 保存于-20℃備用。

1.2.2 醫學外顯子組序列分析

通過快速QF-PCR（Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction）法對D13S252、D18S386、D21S11 等26 個STR 位點進行檢測，分析胎兒染色體非整倍體情況，及排除所采集的胎兒標本無母體DNA 污染。將提取的孕婦及丈夫外周血全基因組DNA 及產前診斷標本（羊水/臍血）DNA各100 μL，送至廣州嘉檢醫學檢測有限公司進行與人類疾病相關的4 000 個已知基因編碼外顯子區域及側翼區的序列分析。測序后獲得的原始數據通過使用BWA 軟件進行序列比對，采用GATK 和Var Scan 軟件對變異進行識別，包括單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入與缺失等進行檢測、注釋和統計分析。利用Annovar 軟件從外部數據庫進行變異位點注釋，以評估給定的序列變異的影響。根據數據分析結果，參考db SNP 數據庫和HGMD 數據庫找出可能的致病突變。并對致病變異進行Sanger 測序驗證。通過數據庫查找具有代表性的不同物種間該位點氨基酸保守性分析，以期揭示突變區域是否高度保守。

1.2.3 Sanger 測序驗證

根據經醫學外顯子組高通量測序后分析結果，使用Sanger 測序方法對胎兒及父母變異位點進行驗證。采用Primer5 軟件設計引物，用聚合 酶 鏈 反 應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技 術 擴 增CUL7基 因（NM_014780）變異位點c.2416C＞T（R806*）、c.3489delG（W1163Cfs*44）、CUL7基因（NM_001168370）c.5011C＞T（p.Q1671*）、c.4585C＞T（p.R1529*）相應外顯子及其側翼序列，引物由天一輝遠廣州基因科技，有限公司合成，引物序列如下表3。按以下條件進行進行PCR擴 增：LATaq 預 混 液12.5 μL，甜 菜 堿5 μL，正、反向引物各1 μL，樣本DNA 1 μL，無核酸水至25 μL；PCR 反應條件為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸40 s，進行40 個循環；最后72℃延伸10 min。PCR 產物送至天一輝遠廣州基因科技有限公司進行Sanger 測序。

表3 CUL7 基因各變異位點引物序列Table 3 Primer sequences of each variant locus of CUL7 gene

1.2.4 隨訪

追蹤妊娠結局，包括出生孕周，分娩方式，出生體重等信息，對引產標本進行尸檢，包括大體檢查和顯微鏡檢查等。

2 結果

2.1 醫學外顯子組測序結果

2.1.1 高通量測序數據質控參數

基因包檢測區間覆蓋有人類基因組中致病機制明確的4 000 個相關基因，74 566 個編碼區總共含有12 424 088 個堿基。平均覆蓋深度256+/-180X，大于10X 覆蓋區間占97.4%，大于20X 覆蓋區間占94.4%，參考序列版本號：GRCh37/hg19。

2.1.2 醫學外顯子檢測突變及Sanger測序驗證結果

通過數據分析后發現病例一中胎兒CUL7基因存在復合雜合變異位點c.2416C＞T（p.R806*）（父親雜合）和c.3489delC（p.F1164Sfs*61）（母親雜合）。發現病例二中胎兒CUL7基因存在復合雜合變異位點c.5011C＞T（p.Q1671*）（父親雜合）、CUL7基 因c.4585C＞T（p.R1529*）（母 親 雜 合）。Sanger 測序結果與高通量測序結果一致。

2.2 隨訪

兩對夫妻經遺傳咨詢后，均決定放棄本次妊娠。病例1 胎兒于33+周順產娩出，男胎，重1 365 g。大體表現為：前額突出、頭圍相對偏大、三角臉、鼻梁低平、肉的朝天鼻、唇部飽滿、尖下頜、四肢明顯短小、后跟突出。解剖結果與產前超聲基本吻合：四肢短粗。鏡下：取脛骨干骺端，見軟骨細胞增多，交界線整齊。全身X 光提示：前額突出，唇部飽滿，四肢長骨明顯短小，管型骨。病例2胎兒于30 周順產娩出，為男胎，孕婦及家屬拒絕進一步尸檢及大體檢查。

3 討論

3M 綜合征是一種罕見的遺傳性疾病，迄今為止，僅有約100 余例3M 綜合征的報道，中國僅報道了4 例病例［5-6］，而關于3M 綜合征胎兒產前診斷研究報道更少［7］。3M 患者的典型面部特征往往直到青春期才出現，一些臨床表型并非僅限于3M綜合征，故對3M 綜合征的診斷，臨床表型往往缺乏特異性，容易漏診。本研究中病例1 中引產胎兒有嚴重生長遲緩，特征性面容（相對頭大、三角臉、鼻尖多肉、長人中、嘴寬唇厚、尖下巴），影像學表現（長骨細，明顯短小，管型骨），與3M 綜合征的臨床診斷基本是符合的。大多數3M 綜合征患者于兒童期或成年后診斷，若無先證者，極難在產前明確診斷。其產前超聲無特異表現，部分文獻報道宮內有NT 增厚表現［3］，在本研究中，病例一胎兒在妊娠12+1周發現NT 增厚4.2 mm，病例2 中胎兒NT 正常范圍。還有一些文獻報道了另外一個非特異性超聲表現是宮內發育遲緩［3，8-9］，本研究中2例胎兒都呈現隨著孕周進行性加重的胎兒四肢長骨小于孕周，而雙頂徑，頭圍和腹圍都大致正常。由于目前產前報道的3M 綜合征較少，目前宮內報道的超聲表現——宮內生長發育遲緩和NT 增厚并不特異，不是3M 綜合征所特有的，故本病的確診還需要進一步的分子診斷。

文獻研究表明，CUL7基因是3M 綜合征的主要致病基因［4］，它位于6p21.1，包含26 個外顯子，編碼包含1 698 個氨基酸的CUL7 蛋白［10］。CUL7蛋白屬于cullin 家族一員，它與SKP1-FBX29（FBXW8）和ROCl 構成泛素連接酶E3，且在泛素連接酶E3 的組裝中起骨架作用［11-12］。CUL7基因的突變可導致CUL7 蛋白功能失調，使其不能招募ROC1，從而阻止了底物在體內的泛素化、降解和積累，這可能在胎兒宮內生長遲緩的機制中發揮重要作用。CUL7基因敲除小鼠胚胎也表現出宮內生長遲緩的現象，可能因為CUL7 蛋白可以與p53 結合，抑制p53 的轉錄激活效應，從而促進細胞增殖，在CUL7基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞中，p53 的活性顯著增加，導致了小鼠的宮內生長發育遲緩［13］。綜上CUL7基因變異可能是導致3M 綜合征的原因。本研究的變異位點中，其中c.2416C＞T（p.R806*）、c.4585C＞T（p.R1529*）與c.5011C＞T（p.Q1671*）變異使得原編碼氨基酸突變為終止密碼子，使得編碼蛋白提前終止（PVS1）；c.3489delC（p.F1164Sfs*61）為缺失變異，堿基的缺失使得后續閱讀框發生了移碼改變，同樣致使編碼蛋白提前終止，正常合成的功能蛋白發生截短而影響蛋白發揮正常功能（PVS1）。查詢clinvar 數據庫可知，CUL7基因的致病和疑似致病變異中，主要以無義變異（28：67）和移碼變異（24：67）為主；查詢gnomAD 數據庫得知上述變異人群頻率極低（PM2_Supporting），采用varcards（http：//varcards.biols.ac.cn/）在線針對上述變異位點進行生物信息學致病性分析，預測為致病的可能性較大。綜合分析按照ACMG 指南的致病性分析評級為LP（疑似致病變異）。

本研究利用高通量測序技術成功鑒定了兩例CUL7基因復合雜合變異導致的中國人3M 綜合征的新變異，新變異的發現豐富了中國人群的胎兒宮內生長發育遲緩的遺傳信息。