UCHL1-AS1/miR-629 軸調控食管癌細胞增殖、遷移和侵襲的調控機制

王佳 許紅英 高峰★ 嚴士海

食管癌是常見的惡性腫瘤之一，發病機制尚未明了［1］。反義泛素C 端水解酶L1（antisense ubiquitin carboxylterminal hydrolaseL 1，UCHL1 -AS1）是一種長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），因與常規編碼基因泛素C 端水解酶L1（antisense Uchl1，UCHL1）互補而得名。研究顯示，上調UCHL1-AS1 可有效抑制肝癌細胞遷移［2］，增強雷帕霉素對人肝癌細胞Bel-7404 增殖的抑制作用［3］，但UCHL1-AS1 在食管癌中的表達及其對食管癌細胞惡性生物學行為的影響還未知。生物信息學軟件預測顯示，miR-629 是UCHL1-AS1的靶基因。miR-629 是肝癌［4］、宮頸癌［5］等腫瘤組織或細胞中表達升高的微小RNA（microRNA，miRNA），對這些腫瘤的發展起促進作用。但miR-629 對食管癌發生發展的影響還未知。本研究旨在觀察UCHL1-AS1/miR-629 軸對食管癌Eca-109細胞增殖、遷移和侵襲的影響，以期為食管癌發病機制的闡明及治療靶點的選擇提供新途徑。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019 年3 月至2020 年2 月于南京中醫藥大學附屬醫院行手術切除的33 例食管癌患者食管癌組織及癌旁組織（距離原發灶＞3 cm，病理檢測未發現癌細胞），液氮保存。男19 例，女14 例，平均（57.3±8.24）歲。納入標準：初發食管癌；術前未行放化療、免疫治療等抗腫瘤治療。排除標準：合并其他惡性腫瘤；合并慢性病者；合并血液系統疾病、自身免疫疾病等。研究符合《赫爾辛基宣言》原則。

1.2 實驗材料

Eca-109 細胞系，中國科學院上海細胞庫；胎牛血清，美國Hycolne 公司；RPMI 1640 培養基、MTT、BCA 蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒，北京索萊寶；LipofectamineTM2000 試劑盒，美國Invitrogen 公司；PCR 實驗相關試劑盒，大連寶生物；引物序列、UCHL1-AS1 過表達載體（pcDN3.1-UCHL1-AS1）、空載體（pcDNA3.1）、miR-629 抑制劑（anti-miR-629）、抑制劑陰性序列（antimiR-NC）、野生型（WT）和突變型（MUT）UCHL1-AS1 熒光素酶報告載體，上海吉凱基因化學技術有限公司；蛋白質印跡實驗相關抗體，北京中杉。

1.3 方法

1.3.1 RT-qPCR 檢測UCHL1-AS1 和miR-629 表達用RNA 提取試劑盒獲取組織中總RNA，反轉錄為cDNA，進行PCR 反應。引物序列：UCHL1-AS1 上游5′-AGG CCAGATGAGGAAACTG A-3′，下游5′-AAGGTGGACACCAGCTCATC-3′；miR-629 上 游5′-G TCGAAAGCTGCGCTGC GTGACGT-3′，下游5′-CGDTAGCGCGTDGCGGDGTCG-3′。 2-ΔΔCt法 計 算UCHL1-AS1 相 對GAPDH、miR-629 相對U6 的表達。

1.3.2 細胞培養和轉染

用含10 % FBS 的RPMI 1640 培養基培養Eca-109 細胞。將Eca-109 細胞接種至6 孔板中，接種濃度為1×105個/孔。培養24 h 后，利用LipofectamineTM2000 試劑盒分別轉染pcDN3.1-UCHL1-AS1（pcDN3.1-UCHL1-AS1 組）、pcDN3.1（pcDN3.1組）、anti-miR-629（anti-miR-629 組）、anti-miR-NC（anti-miR-NC 組）、共轉染pcDN3.1-UCHL1-AS1 與anti-miR-NC（pcDN3.1-UCHL1-AS1+anti-miR-NC組）、pcDN3.1 - UCHL1 - AS1 與anti - miR - 629（pcDN3.1-UCHL1-AS1+anti-miR-629組），轉染時間6 h。RT-qPCR 法檢測細胞中UCHL1-AS1 或miR-629 表達，驗證轉染效果后，將細胞用于后續實驗。

1.3.3 MTT 法檢測細胞存活率

將六組細胞接種至96 孔板中，接種濃度為2.5×104個/孔。培養24 h 后，加20 μL 5 g/L MTT，孵育4 h。棄培養基，加150 μL 二甲基亞砜，振蕩混勻，酶標儀490 nm 處測定吸光度值（A）。細胞存活率（%）=A實驗組/A對照組×100%。實驗重復3 次。

1.3.4 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲

遷移實驗：將含8 μm 微孔聚碳酸酯膜的Transwell 小室置于24 孔板中，上室分別接種六組細胞，接種濃度為1.0×104個/孔。下室加500 μL 完全培養基。培養24 h 后，將下室細胞進行固定和染色。顯微鏡觀察，計數。侵襲實驗：鋪Matrigel基質膠于Transwell 上室，自然晾干后，再接種六組細胞，其余步驟同遷移實驗。

1.3.5 Western Blot 法 檢 測Ki67、N-cadherin 和E-cadherin 蛋白表達

將六組細胞接種至6 孔板中，接種濃度為1.0×105個/孔。培養24 h 后，用RIPA 試劑提取細胞中總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE 實驗分離總蛋白，并轉至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h。于4℃冰箱中，分別用Ki67（1∶1 000）、N-cadherin（1∶2 000）、E-cadherin（1∶2 000）和GAPDH（1∶1 000）一抗孵育過夜，洗膜后，置于山羊抗兔二抗（1∶5 000）中，37℃孵育2 h。滴加顯液顯影，曝光拍照。

1.3.6 UCHL1-AS1 與miR-629 靶向關系驗證

將Eca-109 細胞接種至6 孔板中，接種濃度為1×105個/孔。培養24 h 后，利用LipofectamineTM2000 試劑盒分別共轉染WT-UCHL1-AS1 與miR-629 mimic（或miR-NC）、MUT-UCHL1-AS1 與miR-629 mimic（miR-NC），轉染時間為6 h。然后裂解細胞，以離心半徑10 cm、3 500 r/min 離心10 min 后，取上清液，分別加100 μL 螢火蟲或海腎熒光素酶反應工作液，檢測螢火蟲和海腎的熒光強度。以螢火蟲與海腎熒光強度的比值表示熒光素酶活性。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 UCHL1-AS1 在食管癌中的表達

食管癌組織UCHL1-AS1 表達低于癌旁組織［（0.18±0.03）vs（1.02±0.05）］，差異有統計學意義（t=82.755，P＜0.05）。

圖1 UCHL1-AS1在食管癌組織中的表達（DAB顯色，×400）Figure 1 Expression of UCHL1-AS1 in esophageal cancer tissue（DAB color，×400）

2.2 UCHL1-AS1 對Eca-109 細胞增殖、遷移和侵襲的影響

pcDN3.1-UCHL1-AS1 組Eca-109 細胞存活率、遷移數、侵襲數、Ki67 蛋白及N-cadherin 蛋白水平均低于pcDN3.1 組；UCHL1-AS1、E-cadherin 蛋白水平高于pcDN3.1 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1、圖2。

表1 UCHL1-AS1 對Eca-109 細胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s）Table 1 Effects of UCHL1-AS1 on proliferation，migration and invasion of Eca-109 cells（±s）

表1 UCHL1-AS1 對Eca-109 細胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s）Table 1 Effects of UCHL1-AS1 on proliferation，migration and invasion of Eca-109 cells（±s）

組別pcDN3.1-UCHL1-AS1 組pcDN3.1 組t 值P 值n33 UCHL1-AS1 3.23±0.08 1.00±0.05 70.914＜0.001細胞存活率（%）52.29±6.13 100.00±8.17 14.013＜0.001遷移數（個）79.00±5.05 164.00±7.92 27.148＜0.001侵襲數（個）46.00±3.41 98.00±5.10 25.428＜0.001 Ki67 蛋白0.20±0.02 0.78±0.05 32.311＜0.001 N-cadherin 蛋白0.15±0.02 0.67±0.04 34.883＜0.001 E-cadherin 蛋白0.60±0.04 0.21±0.02 26.262＜0.001

圖2 UCHL1-AS1 對Eca-109 細胞遷移、侵襲及相關蛋白表達的影響Figure 2 Effect UCHL1-AS1 on the migration，invasion and expression of related proteins in Eca-109 cells

2.3 UCHL1-AS1 靶向負調控miR-629 表達

共轉染WT-UCHL1-AS1 與miR-629 mimics的細胞熒光素酶活性低于WT-UCHL1-AS1 與miR-NC，差異有統計學意義［（0.19±0.02）vs（0.95±0.05），t=42.339，P＜0.05］；共轉染MUT-UCHL1-AS1 與miR-629 mimics、MUT-UCHL1-AS1 與miRNC 細胞熒光素酶活性差異無統計學意義［（0.97±0.05）vs（0.96±0.05），t=0.424，P=0.677］。與pcDN3.1 組比較，pcDN3.1-UCHL1-AS1 組Eca-109 細胞中UCHL1-AS1 表達水平升高，miR-629表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 UCHL1-AS1 靶向負調控miR-629 表達（±s）Table 2 Expression of miR-629 negatively regulated by UCHL1-AS1 targeting（±s）

表2 UCHL1-AS1 靶向負調控miR-629 表達（±s）Table 2 Expression of miR-629 negatively regulated by UCHL1-AS1 targeting（±s）

組別pcDN3.1-UCHL1-AS1 組pcDN3.1 組t 值P 值n33 UCHL1-AS1 3.21±0.07 1.02±0.05 44.095＜0.001 miR-629 0.25±0.03 0.99±0.05 38.073＜0.001

2.4 下調miR-629 對Eca-109 細胞增殖、遷移和侵襲的影響

anti-miR-629 組Eca-109 細胞中的miR-629、細胞存活率、遷移數、侵襲數及Ki67 蛋白和N-cadherin 蛋白水平均低于anti-miR-NC 組；E-cadherin 蛋白高于anti-miR-NC 組，差異有統計學意義（P均＜0.05）。見表3、圖3。

圖3 下調miR-629 對Eca-109 細胞遷移、侵襲及相關蛋白表達的影響Figure 3 Effects of down-regulated miR-629 on migration，invasion and related protein expression of Eca-109 cells

表3 下調miR-629 對Eca-109 細胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s）Table 3 Effects of down-regulation of miR-629 on proliferation,migration and invasion of Eca-109 cells（±s）

表3 下調miR-629 對Eca-109 細胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s）Table 3 Effects of down-regulation of miR-629 on proliferation,migration and invasion of Eca-109 cells（±s）

組別anti-miR-629 組anti-miR-NC 組t 值P 值n33 miR-629 0.21±0.02 1.02±0.05 45.124＜0.001細胞存活率（%）56.52±6.51 100.02±8.15 12.511＜0.001遷移數（個）87.00±5.37 165.00±7.93 24.433＜0.001侵襲數（個）56.00±3.83 99.00±5.14 20.125＜0.001 Ki67 蛋白0.31±0.03 0.79±0.05 24.696＜0.001 N-cadherin 蛋白0.24±0.03 0.68±0.04 26.400＜0.001 E-cadherin 蛋白0.51±0.04 0.22±0.02 19.454＜0.001

2.5 下調miR-629 可增強UCHL1-AS1 對Eca-109細胞增殖、遷移和侵襲的影響

pcDN3.1-UCHL1-AS1+anti-miR-629 組Eca-109細胞中的miR-629、細胞存活率、遷移數、侵襲數及Ki67 蛋白和N-cadherin 蛋白均低于pcDN3.1-UCHL1-AS1+anti-miR-NC 組；E-cadherin 蛋白高于pcDN3.1-UCHL1-AS1+anti-miR-NC 組，差異有統計學意義（P均＜0.05）。見表4、圖4。

圖4 下調miR-629 增強UCHL1-AS1 對Eca-109 細胞遷移、侵襲及相關蛋白表達的影響Figure 4 Down-regulating miR-629 enhanced the effect of UCHL1-AS1 on migration，invasion and expression of related proteins in Eca-109 cells

表4 下調miR-629 可增強UCHL1-AS1 對Eca-109 細胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s）Table 4 Down-regulation of miR-629 can enhance the effects of UCHL1-AS1 on proliferation,migration and invasion of Eca-109 cells（±s）

表4 下調miR-629 可增強UCHL1-AS1 對Eca-109 細胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s）Table 4 Down-regulation of miR-629 can enhance the effects of UCHL1-AS1 on proliferation,migration and invasion of Eca-109 cells（±s）

組別pcDN3.1-UCHL1-AS1+anti-miR-629 組pcDN3.1-UCHL1-AS1+anti-miR-NC 組t 值P 值n 33 miR-629 0.35±0.03 0.99±0.05 32.928＜0.001細胞存活率（%）34.68±3.18 52.27±5.26 4.957 0.008遷移數（個）52.00±3.65 80.00±5.11 13.376＜0.001侵襲數（個）28.00±2.46 47.00±3.44 13.478＜0.001 Ki67蛋白0.06±0.01 0.21±0.02 20.125＜0.001 N-cadherin蛋白0.03±0.01 0.17±0.02 17.441＜0.001 E-cadherin蛋白0.93±0.06 0.61±0.04 13.313＜0.001

3 討論

LncRNA 為長度超過200 個核苷酸的分子非編碼RNA，可發揮miRNA 分子海綿作用調控靶基因的表達，LncRNA/miRNA/靶基因這一調控通路在腫瘤的發生發展中起重要作用。目前已報道多種LncRNA 在食管癌中異常表達，為食管癌發病機制闡明及治療靶點選擇提供了新途徑［6］。UCHL1-AS1 作為近年新發現的一種LncRNA，與UCHL1 基因互補，且二者呈正調控的關系。Carrier團隊［7］通過構建過表達UCHL1-AS1 小鼠神經元細胞，發現內源性、外源性UCHL1 蛋白表達量均增加。并且在雷帕霉素作用下，UCHL1-AS1 從細胞核轉移到細胞漿的同時，UCHL1 蛋白表達同樣呈增加狀態。UCHL1 蛋白具有抑癌或促癌的雙向調節作用，而閆文姬等［8］的研究表明，UCHL1 蛋白受啟動子區高甲基化調控呈低表達，從而參與了食管癌變的發生發展過程。目前UCHL1-AS1 在食管癌中的研究才剛起步，其對食管癌發生發展的影響和機制還未知，因此本研究特對此展開探究。

本研究結果顯示，食管癌組織UCHL1-AS1 表達明顯低于癌旁組織，上調UCHL1-AS1 導致食管癌細胞增殖、遷移及侵襲能力受到抑制，提示UCHL1-AS1 作為抑癌基因參與食管癌的進展過程，可作為食管癌治療的分子靶點。Ki67 是一種與細胞增殖特異相關的核蛋白，與核糖體RNA 的轉錄有關，其表達升高可促進細胞增殖［9］。上皮間質轉化是腫瘤細胞遷移和侵襲的主要機制之一，主要特點是上皮型鈣黏蛋白E-cadherin 表達降低，而神經型鈣黏N-cadherin 表達升高［10-11］。本實驗數據顯示，上調UCHL1-AS1 表達降低了Eca-109細胞中Ki67 和N-cadherin 蛋白表達，但促進了E-cadherin 蛋白表達，進一步說明上調UCHL1-AS1抑制Eca-109 細胞的惡性行為。

此外，本研究證實了UCHL1-AS1 靶向結合并負調控miR-629 表達。miR-629 是一個在多種腫瘤中異常表達的miRNA。miR-629 在胃癌組織中表達上調，下調miR-629 降低胃癌細胞的增殖能力，并促進細胞凋亡，miR-629 可能是胃癌的治療 靶 標［12］；胰 腺 癌 中miR-629 表 達 上 調，下 調miR-629 表達可能通過靶向上調FOXO3 抑制胰腺癌細胞的細胞增殖和遷移［13］；卵巢癌組織中miR-629 上調，上調miR-629 表達促進卵巢癌細胞遷移和侵襲能力，并抑制細胞凋亡［14］。本研究顯示，下調miR-629 表達可有效抑制食管癌Eca-109細胞增殖、遷移和侵襲，且可增強UCHL1-AS1 對Eca-109 細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示UCHL1-AS1 可能通過靶向下調miR-629 表達發揮抗食管癌作用，但UCHL1-AS1 具體作用于miR-629 的靶基因還有待進一步探究。

綜上，UCHL1-AS1 在食管癌組織中表達下調，上調UCHL1-AS1 導致食管癌Eca-109 細胞增殖、遷移和侵襲能力顯著降低，這可能與上調UCHL1-AS1 導致細胞中miR-629 表達降低有關。接下來，本研究將進一步探討UCHL1-AS1 影響食管癌細胞惡性生物學行為的其他作用機制及對移植瘤裸鼠腫瘤生長的影響，以期為食管癌的靶向分子治療提供新途徑。