不同預處理方法消除流式細胞術檢測細胞因子分析干擾的效果

唐甜，王盼，劉宇思，姜擁軍，趙敏，張子寧

（中國醫科大學 1.國家衛生健康委員會艾滋病免疫學重點實驗室；2.國家醫學檢驗臨床醫學研究中心；3.遼寧省艾滋病免疫學重點實驗室；4.附屬第一醫院檢驗科，沈陽 110001）

細胞因子作為一種小分子蛋白，在炎癥、感染、腫瘤、自身免疫病等多種疾病的發生、發展中具有重要意義，可為免疫相關疾病的診斷、預后評估、療效監測等提供輔助診斷依據［1］。目前，隨著流式細胞術的不斷發展，利用流式細胞儀檢測患者血清或血漿中的細胞因子水平被越來越廣泛地用于臨床［2］。流式細胞術檢測細胞因子基于流式微球陣列技術，可同時檢測一份血清或血漿樣本中的多種細胞因子，且具有需要樣本量少、省時、操作簡單等優點。然而，嗜異性抗體（heterophil antibody，HA）的存在會對基于抗原和抗體的免疫測定法產生干擾，影響流式細胞術檢測細胞因子的特異度和準確性［3-4］。因此，本研究采用稀釋法、20%聚乙二醇6000（polyethylene glycol 6000，PEG-6000）沉淀法和嗜異性抗體阻斷管（heterophilic blocking tube，HBT）預處理流式細胞術細胞因子檢測結果異常升高的血漿樣本，并將預處理后血漿樣本的白細胞介素（interleukin，IL）-6流式細胞術檢測結果與電化學發光法檢測結果進行比較，以探索有效解決流式細胞術細胞因子檢測結果異常升高的血漿樣本干擾的方法，為臨床診治提供準確的檢測結果。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2021年6月至9月中國醫科大學附屬第一醫院檢驗科采用流式細胞術檢測的血漿樣本2 100例，本研究納入細胞因子異常升高的血漿樣本，共32例。納入標準：（1）流式細胞術檢測結果中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）7種細胞因子均異常升高；（2）流式細胞術檢測圖形異常；（3）部分細胞因子檢測結果與患者臨床表現以及C反應蛋白、白細胞計數和紅細胞沉降率檢測結果不符。

同期隨機收集正常對照血漿樣本14例。納入標準：（1）細胞因子檢測圖形正常，且細胞因子檢測結果與患者臨床表現以及C反應蛋白、白細胞計數和紅細胞沉降率檢測結果相符；（2）性別、年齡等因素與異常樣本相匹配。本研究通過中國醫科大學附屬第一醫院醫學倫理委員會審核和批準［科倫審2021（518）號］。

1.2 儀器和試劑

BD FACS CantoⅡ流式細胞分析儀（美國BD公司），細胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ和TNF）聯合檢測試劑盒（江西賽基生物科技有限公司），20% PEG-6000（國藥集團化學試劑有限公司），HBT（美國CANTIBODIES公司），Cobas 8000A電化學發光儀（美國羅氏公司）。

1.3 樣本采集、預處理和檢測

1.3.1 樣本采集：將外周靜脈血置于乙二胺四乙酸真空采血管中，在室溫條件下2 000g離心10 min后，留取血漿進行細胞因子檢測。

1.3.2 樣本預處理：對32例細胞因子異常升高的血漿樣本分別進行不同預處理后，采用流式細胞術檢測血漿細胞因子水平。

1.3.2.1 稀釋法預處理 使用細胞因子檢測試劑的配套樣本稀釋液，對血漿樣本進行2倍、4倍和8倍稀釋。

1.3.2.2 PEG-6000預處理 將20% PEG-6000與等體積的血漿充分混勻，于室溫條件下振蕩1 h后，350g離心10 min，吸取上清液進行細胞因子檢測。

1.3.2.3 HBT預處理 取500 μL血漿，加入阻斷管中靜置1 h，吸取上清液進行細胞因子檢測。

1.3.3 流式細胞術檢測血漿細胞因子水平：將孵育好、包被7種細胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ和TNF）特異性抗體的捕獲微球振蕩混勻后，向每個樣品管中加入25 μL。再向所有管中分別加入25 μL 藻紅蛋白熒光檢測試劑和25 μL待測血漿，振蕩混勻，室溫避光孵育3 h。待孵育完成后，每管加入1 mL PBS洗滌，350g離心5 min，棄上清后向每管加入100 μL PBS，振蕩重懸后，上BD FACS Canto Ⅱ流式細胞儀進行檢測，采用FCAP Array軟件分析、計算結果。

1.3.4 電化學發光法檢測IL-6水平：將未經預處理的血漿2 000g離心10 min后，直接采用Cobas 8000A電化學發光儀進行檢測。

1.4 統計學分析

使用FacsDivaTM軟件處理流式細胞術獲得的數據，應用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料用M（P25～P75）表示，2組間配對比較采用Wilcoxon檢驗，多組間配對比較采用Friedman檢驗。相關性分析采用Spearman相關分析，一致性分析采用Bland-Altman法。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞術檢測血漿細胞因子結果分布情況

2 100例血漿樣本中，2 068例（98.5%）血漿樣本中7種細胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ和TNF）流式細胞術檢測圖形正常（以下簡稱正常表現），包括所有細胞因子表達水平在參考區間內（圖1A）或部分細胞因子表達水平高于參考區間上限（圖1B），32例（1.5%）血漿樣本多細胞因子流式細胞術檢測圖形異常（以下簡稱異常表現），表現為流式細胞術檢測圖形拉長（圖1C），或所有細胞因子流式細胞術檢測結果均異常升高（圖1D）。32例細胞因子異常表現的血漿樣本中，24例（75.0%）來源于風濕免疫科，4例（12.5%）來源于腫瘤內科，3例（9.4%）來源于血液科，1例（3.1%）來源于器官移植科。

圖1 血漿細胞因子流式細胞術檢測圖Fig.1 Flow cytometry detection diagram of cytokines in plasma

2.2 稀釋法預處理血漿樣本后細胞因子的檢測結果

將血漿樣本2倍、4倍、8倍稀釋后，應用流式細胞術檢測血漿中7種細胞因子的表達水平。在32例細胞因子異常表現的血漿樣本中，7種細胞因子的檢測結果與稀釋倍數未呈線性關系（P＞ 0.05，r＜0.97）的比例均＞60%（圖2A）。在14例細胞因子正常表現的血漿樣本中，7種細胞因子的流式細胞術檢測結果與稀釋倍數均呈較好的線性關系，以IL-6為例（P＜ 0.05，r＞ 0.97），見圖2B；而在32例細胞因子異常表現的血漿樣本中，血漿樣本稀釋后21例（65.6%）IL-6檢測結果與稀釋倍數的線性關系較差（P＞ 0.05，r＜ 0.97，圖2C），其余11例（34.4%）IL-6檢測結果與稀釋倍數呈較好的線性關系。

圖2 血漿樣本經倍比稀釋后細胞因子的表達情況Fig.2 Expression of cytokines in plasma pretreated by a multiple dilution method

2.3 PEG-6000沉淀法和HBT預處理血漿樣本后細胞因子的檢測結果

細胞因子異常表現的血漿樣本經PEG-6000沉淀法或HBT預處理后，應用流式細胞術檢測血漿中7種細胞因子的表達水平，結果發現，細胞因子異常升高的現象均得到改善，見圖3。

圖3 應用流式細胞術檢測不同方法預處理細胞因子異常表現的血漿樣本后7種細胞因子的檢測結果Fig.3 Seven cytokines in plasma samples detected by flow cytometry after different pretreatment methods

細胞因子正常表現的血漿樣本經PEG-6000沉淀法和HBT預處理后，與未經預處理的血漿樣本比較，7種細胞因子的檢測結果無統計學差異（P＞0.05，圖4A）。

與稀釋倍數未呈線性關系的細胞因子異常表現的血漿樣本，經PEG-6000沉淀法和HBT預處理后，7種細胞因子的流式細胞術檢測結果均明顯低于未經預處理的血漿樣本（PEG-6000：均P＜ 0.001；HBT：均P＜ 0.01），見圖4B～4H。與稀釋倍數呈線性關系的細胞因子異常表現的血漿樣本，經PEG-6000沉淀法和HBT預處理后，部分細胞因子流式細胞術檢測結果明顯低于未經預處理的血漿樣本（PEG-6000：IL-6，P＜ 0.01，IL-10，P＜ 0.01，IFN-γ，P＜ 0.01，TNF，P＜ 0.000 1；HBT：IL-10，P＜ 0.01，IFN-γ，P＜0.01；TNF，P＜ 0.000 1），見圖4I～4O。

圖4 PEG-6000沉淀法和HBT預處理血漿樣本后細胞因子的檢測結果Fig.4 Expression levels of the cytokines in plasma samples pretreated by PEG-6000 precipitation and HBT

2.4 不同方法預處理血漿樣本后流式細胞術與電化學發光法IL-6檢測結果的相關性和一致性

對32例細胞因子異常表現的血漿樣本（包括11例與稀釋倍數呈線性關系的血漿樣本和21例與稀釋倍數未呈線性關系的血漿樣本）進行PEG-6000沉淀法和HBT預處理。結果發現，未經預處理血漿樣本的IL-6流式細胞術檢測結果與電化學發光法檢測結果的相關系數低，經PEG-6000沉淀法和HBT預處理后血漿樣本的IL-6流式細胞術檢測結果與電化學發光法檢測結果的相關性增加，且PEG-6000沉淀法預處理的血漿樣本IL-6檢測結果與電化學發光法檢測結果的相關系數高于HBT預處理的血漿樣本（與稀釋倍數呈線性關系的血漿樣本：PEG-6000，r=0.981 7，HBT，r=0.761 5，圖5A～5C；與稀釋倍數未呈線性關系的血漿樣本：PEG-6000，r=0.854 4，HBT，r=0.830 9，圖5D～5F）。

圖5 不同方法預處理血漿樣本后流式細胞術與電化學發光法IL-6檢測結果的相關性Fig.5 Correlation of IL-6 detected by flow cytometry after different pretreatment methods and electrochemiluminescence

進一步進行Bland-Altman分析，結果發現，未經預處理、PEG-6000沉淀法預處理和HBT預處理后的血漿樣本中，流式細胞術與電化學發光法IL-6檢測結果具有較好的一致性，約90.5%（19/21，21例與稀釋倍數未呈線性關系的血漿樣本）～90.9%（10/11，11例與稀釋倍數呈線性關系的血漿樣本）的點在95%一致性界限以內。且PEG-6000沉淀法差值的絕對值以及差值的標準差最?。ㄅc稀釋倍數呈線性關系的血漿樣本：-1.80±3.57；與稀釋倍數未呈線性關系的血漿樣本：-2.17±5.15），表明PEG-6000沉淀法預處理血漿后，流式細胞術與電化學發光法IL-6檢測結果的一致性更好。見圖6。

圖6 不同方法預處理血漿樣本后流式細胞術與電化學發光法IL-6檢測結果的一致性Fig.6 Consistency of IL-6 detected by flow cytometry after different pretreatment methods and electrochemiluminescence

3 討論

HA是人體內源性抗體，在人類接種來源于動物的疫苗以及直接接觸已經污染的食物、動物后會產生HA［5］。HA能與多個物種的免疫球蛋白非特異性結合，屬多重特異性免疫球蛋白。因此，體內含HA的患者在做血清免疫檢測時，HA可與試劑抗體結合而產生干擾。HA的干擾通常會對一種或多種分析物造成錯誤的高值結果，假性高值結果較常見［6-7］，與本研究發現的細胞因子檢測假性升高情況符合。研究發現，存在于人體中的HA包括天然抗體和自身免疫抗體，天然抗體分為天然多特異性抗體、獨特型抗體和類風濕性因子，大多數的HA屬于天然抗體，是免疫檢測分析干擾的主要類型［8］。我院絕大部分患者7種細胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ和TNF）的檢測結果均正常，32例細胞因子檢測結果出現異常升高的患者中，24例來自風濕免疫科，其中23例類風濕因子升高。提示類風濕因子升高可能是干擾流式細胞術多細胞因子檢測結果的主要原因，臨床檢測發現細胞因子圖形異?；蚺c臨床不符時，可關注類風濕因子表達水平。

鑒于HA的多重源性，目前尚無一種能夠完全消除HA干擾的手段。連續稀釋實驗是發現免疫反應中內源性抗體和測量不準確性的有效方法，將血漿樣本稀釋后，能夠降低HA濃度，從而降低原有的干擾強度［9-10］。本研究中，21例患者（21/32）的待檢血漿樣本經連續稀釋后，細胞因子的檢測結果與稀釋倍數仍未呈明顯線性關系，稀釋法有效降低干擾的效率僅為34.5%，效果不明顯。另外，在與稀釋倍數呈線性關系的樣本中，PEG-6000、HBT預處理后血漿樣本的細胞因子流式細胞術檢測結果以及未經預處理血漿樣本的細胞因子電化學發光法檢測結果大部分降低，部分細胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-10等顯著下降，這種情況可能是由于這些患者體內HA具有較強的抗體結合能力，不會隨著稀釋而下降［11］。因此，檢測結果與稀釋倍數呈線性關系的樣本也不能排除存在HA干擾。

另外一種降低HA干擾的方法是使用HA阻斷劑，加入阻斷試劑或使用HBT，均是利用阻斷劑與HA結合從而達到減少干擾的目的。研究［12］報道，HBT能有效降低電化學發光免疫法檢測游離前列腺特異性抗原等細胞因子的假陽性率。目前，細胞因子檢測尚無金標準，本研究更換了檢測平臺，同時使用電化學發光法檢測IL-6的水平，HBT預處理后的血漿樣本流式細胞術檢測結果與電化學發光檢測結果的相關性有所提高，與稀釋倍數呈線性關系的樣本差值的絕對值由原來的10.48 pg/mL降為6.07 pg/mL，與稀釋倍數未呈線性關系的樣本差值的絕對值由原來的16.70 pg/mL降為4.97 pg/mL，且從流式細胞術檢測圖形來看，HBT預處理也能較好地矯正檢測圖形（圖4C）。因此，HBT在一定程度上能夠有效降低干擾。但是，本研究結果中也出現HBT預處理未能有效降低細胞因子檢測結果異常升高的情況，檢測圖形也未得到明顯改善，這可能因為這些樣本中存在HBT預處理不能阻斷的大分子蛋白。

PEG-6000是一種大分子聚合物，具有很強的親水性，可以破壞水化層使蛋白質分子發生脫水，同時通過空間排斥作用擠壓以及依靠鏈長纏繞蛋白質分子而使其發生沉淀，25% PEG-6000溶液可完全沉淀IgG和IgM以及高達80%的IgA［12］。PEG-6000能有效降低腎上腺激素、促甲狀腺素、腫瘤標志物、心臟生物標志物等檢測中HA干擾導致的非特異性反應［13-15］。本研究使用PEG-6000降低HA的干擾，結果發現，加入20% PEG-6000對流式細胞術檢測細胞因子的正常表現結果不產生影響。對于流式細胞術檢測圖形異常表現結果，與稀釋倍數呈線性關系的血漿樣本流式細胞術IL-6檢測結果與電化學發光法檢測結果的相關性較好，配對數據差值的絕對值由原來的10.48 pg/mL降為1.80 pg/mL，與稀釋倍數未呈線性關系的血漿樣本流式細胞術IL-6檢測結果與電化學發光法檢測結果的相關性增加，配對數據差值的絕對值由原來的16.70 pg/mL降為2.17 pg/mL，而且PEG-6000沉淀法能較好地矯正流式細胞術檢測圖形。因此，PEG-6000沉淀法可以有效減弱分析干擾。

綜上所述，應用流式細胞術檢測細胞因子時，如發現異常流式細胞術檢測圖形，應考慮是否存在干擾，PEG-6000沉淀法和HBT均能在一定程度上降低HA的干擾，其中PEG-6000沉淀法的配對數據差值的均數和標準差最小，與電化學發光法的相關性也較好。同時，PEG-6000除了可沉淀HA，對大分子蛋白也有較好的沉淀效果，且其使用成本遠遠低于HBT［12］。因此，細胞因子的流式細胞術檢測中可以嘗試應用PEG-6000沉淀法來減弱內源性抗體的干擾，提高檢測的準確性。