形態選擇性卵胞質內單精子注射治療梗阻性無精子癥1例報告

李然，連方，郭穎

（山東中醫藥大學 1.針炙推拿學院，濟南 250014；2.附屬醫院生殖與遺傳中心，濟南 250014）

梗阻性無精子癥是由于輸精管道梗阻使精子的運輸發生障礙而導致精液中無精子的疾病。外科獲取精子技術和卵胞質內單精子注射技術（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）的誕生和優化成熟，使梗阻性無精子癥患者獲得了擁有親血緣關系后代的機會。形態選擇性卵胞質內單精子注射（intracytoplasmic morphologically selected sperm injection，IMSI）是將活精子細胞器形態學檢測和ICSI結合，在6 000倍以上的放大倍數下，無需染色，實時、高分辨地觀察精子細微結構，挑選出精子頭部空泡較少且各部分形態均正常的活動精子進行受精［1］。研究［2］顯示，梗阻性無精子癥患者行IMSI后，與傳統ICSI相比受精率顯著提高。本文總結了我科采用IMSI治療1例梗阻性無精子癥患者的療效，并結合相關文獻進行回顧分析。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

患者女，27歲，體質量指數19.5 kg/m2。14歲月經初潮，平素月經規律，周期26～30 d，7 d經凈，量中、色紅、質可，無痛經。2017年與丈夫同居，性生活正常（1～2次/周），未避孕。2018年10月于外院就診，基礎內分泌檢查示卵泡刺激素10.50 mmol/L，黃體生成素3.73 mmol/L，雌二醇55.00 mmol/L，孕酮0.34 mmol/L，催乳素13.33 ng/mL，睪酮0.83 ng/mL，抗米勒管激素5.35 ng/mL。經陰道超聲檢查示雙側卵巢各可見5～7枚竇卵泡，子宮、附件無明顯異常。甲狀腺功能正常，免疫檢查正常（抗核抗體譜、抗心磷脂抗體兩項、抗卵巢抗體、抗子宮內膜抗體均陰性），染色體正常。診斷為原發性不孕癥。

2018年男方于外院就診，2次精液常規檢查示精液中無精子，藥物治療無明顯改善，否認外傷手術和生殖器官疾病史，附睪、輸精管、精索靜脈無明顯病變，男性第二性征正常。性激素、染色體未見異常，精漿果糖陰性，葡萄糖甘酶明顯偏低，睪丸穿刺見成熟精子。診斷為原發性不育癥，梗阻性無精子癥。

2018年底于外院行輔助生殖技術助孕，取卵6枚，行經皮附睪穿刺取精結合卵胞質內單精子注射（percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection，PESA-ICSI）受精，形成3枚可移植胚胎，其中2枚第3天（D3）卵裂期胚胎，1枚第5天（D5）卵裂期胚胎。先后分2次移植，均未孕，無剩余胚胎。

2020年5月于我院生殖中心就診，要求助孕治療。2020年7月于我院行第一周期取卵，拮抗劑方案。月經第2天普麗康（荷蘭Organon公司）200 IU 加注射用尿促性素（中國上海麗珠）75 IU啟動促排卵，第7天開始加用思則凱（瑞士Merck Serono有限公司）0.25 mg/d至艾澤（瑞士Merck Serono有限公司）250 μg扳機日（包括扳機日）。促性腺激素（gonadotropin，Gn）用量2 400 IU，使用時間9 d，卵泡數 14個，扳機日雌二醇3 110 pg/mL，黃體生成素1.48 mIU/mL，孕酮0.78 ng/mL，于2020年11月18日獲卵11枚。女方未見明顯異常，因“男方梗阻性無精子癥，原發性不育癥”行PESA-ICSI，正常受精6枚，形成3枚D3胚胎。新鮮胚胎移植2枚D3胚胎未孕，余1枚凍存。

2020年11月行第二周期取卵，因患者上個周期卵巢反應較好，本次仍使用拮抗劑方案。月經第2天果納芬（瑞士Merck Serono有限公司）150 IU加賀美奇（德國Ferring GmbH制藥有限公司）75 IU啟動，第7天加用思則凱0.25 mg/d至艾澤250 μg扳機日（包括扳機日）。Gn用量2 400 IU，使用時間9 d，卵泡數15個，扳機日雌二醇＞5 010 pg/mL，黃體生成素2.65 mIU/mL，孕酮1.04 ng/mL。于2020年7月16日獲卵14枚。考慮到與附睪穿刺相比，睪丸穿刺對患者睪丸內生精小管功能的影響小，能夠避免醫源性附睪梗阻的發生［3］，且2種方式ICSI在安全性和療效方面無顯著差異［4］。為了取得更好的效果，本周期行經皮睪丸穿刺取精結合形態選擇性卵胞質內單精子注射（testicular epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic morphologically selected sperm injection，TESA-IMSI）受精。

1.2 TESA-IMSI實驗室方法

1.2.1 卵母細胞收集和處理：將獲得的卵母細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱（Labotect C200，德國Labotect公司）培養4～6 h，放入含透明質酸酶（80 IU/mL，美國Irvine Scientific公司）的培養液中，脫去周圍的顆粒細胞，選擇成熟的卵母細胞培養備用。

1.2.2 精液收集和處理：常規消毒陰囊皮膚、鋪無菌巾，注射2%利多卡因穿刺側精索阻滯麻醉，用手固定睪丸，使用30 mL注射器沿睪丸橫軸方向多個小角度反復進針3～4次，負壓吸取少量睪丸組織，加入緩沖培養液（瑞典Vitrolife公司）中研磨，在400倍倒置顯微鏡（Nikon Ti-U，日本尼康株式會社）下仔細尋找精子，洗滌后獲得睪丸精子。

1.2.3 顯微操作：用緩沖培養液于玻璃底的平皿（353037，美國FALCON公司）中做數個5 μL液滴，在其中1個液滴中加入精子，無菌石蠟油（瑞典Vitrolife公司）覆蓋。用精子放大系統于6 000倍顯微鏡（Nikon Ti2-U，日本尼康株式會社）下觀察精子的外部形態以及精子頭部有無空泡（圖1），挑選未見頭部空泡且形態活動正常的精子，用顯微操作儀NTX（日本Narishige公司）制動精子，行ICSI。

圖1 活精子細胞器形態學檢測精子形態 ×6 000

1.2.4 胚胎培養和質量評估：準備胚胎序貫培養液，卵裂期胚胎用G-1序貫培養液（瑞典Vitrolife公司），囊胚用G-2序貫培養液（瑞典Vitrolife公司），將顯微注射后的卵子置入，在培養箱37 ℃、5%CO2的條件下培養。注射16～20 h后于顯微鏡下觀察受精情況，出現兩原核為正常受精。只有質量良好的胚胎才能移植。本實驗室質量良好的D3胚胎的特征是至少達到6細胞階段且碎片率＜20%。囊胚采用Gardner評分法［5］評估胚胎質量。

2 結果

D3觀察胚胎情況：正常受精 9枚，可用胚胎9枚；取5枚胚胎培養囊胚，最終獲得5枚胚胎（4枚D3胚胎，1枚D5胚胎），包括2枚優質D3胚胎和1枚囊胚（圖2）。

圖2 胚胎鏡下圖像 ×200

取卵后因患者雌二醇過高，為預防卵巢過度刺激綜合征取消移植。2021年1月行凍融胚胎移植周期助孕，采用激素替代方案調整子宮內膜。因患者要求移植D3胚胎，本周期解凍移植2枚D3胚胎。獲宮內單胎妊娠，2021年10月5日足月順產一女孩，現健康狀況良好。

3 討論

梗阻性無精子癥病因主要包括先天性雙側輸精管缺如、輸精管炎癥導致阻塞、輸精管結扎術后及腹股溝疝、隱睪手術誤扎、誤切輸精管等［6］。有些梗阻性無精子癥患者可以通過手術疏通或重建輸精管恢復生育力，有些因手術失敗或者無法進行手術疏通的患者則選擇輔助生殖技術助孕。

IMSI是一種非侵入性技術，可以在更高放大倍數（6 600～13 000倍）下對精子的頂體、頂體后致密層、頸部、線粒體、尾部和細胞核等6個細微亞細胞結構進行評價，挑選細微形態結構正常、頭部無空泡、活力良好的精子進行顯微注射，以獲得更好的助孕結局。目前人們對IMSI的臨床應用存在爭議，有研究［7-8］報道該技術對臨床妊娠率和活產率無有利影響，而基于不同的不孕原因分類的研究［9-12］結果表明，IMSI對臨床結果有積極的影響。研究［9］發現，當IMSI用于男性因素不育癥和反復植入失敗的患者時，受精率顯著提高。研究［10］顯示，在對嚴謹的觀察性研究進行的薈萃分析中，IMSI與ICSI相比，活產率升高，流產率降低。BALABAN等［11］在一項前瞻性隨機研究中發現，在未按不孕原因進行分類的不孕人群中，IMSI組的胚胎植入率、妊娠率和活產率都有上升的趨勢，而在嚴重男性因素不育夫婦中（如男方梗阻性無精子癥或嚴重少弱畸精子癥），IMSI組的胚胎植入率顯著高于ICSI組。研究［13］顯示，IMSI中正常細胞比例越高，妊娠率越高；而正常細胞比例較高的患者有足夠的正常精子受精，因此在男方因素不占主導地位時，IMSI與ICSI相比并無顯著差異。同時，尚無證據表明IMSI會增加先天性畸形的風險［8］。HERSHKO-KLEMENT等［14］的回顧性分析發現，IMSI不增加畸形率，并可能降低胎兒缺陷、出生缺陷和染色體異常率。

目前IMSI最相關的適應證仍有待確定，一般認為其適用于以下情況：（1）前次ICSI失敗原因不明者；（2）試管嬰兒治療反復多次失敗、無明顯原因的反復流產者；（3）嚴重精子畸形患者（＞90%，傳統評估方法）；（4）從睪丸或附睪取精患者；（5）多次流產且活精子細胞器形態學檢測評估中精子頭部空泡比例高者；（6）≥35歲的男性，以往無卵子因素的周期治療失敗者；（7）多次試管周期中沒有或較少優質胚胎者（排除卵子因素）；（8）受精率低于25%或無受精患者［15］。IMSI是國內新發展的技術，在我國進行相關臨床試驗的生殖中心較少，該技術更多用于實驗研究中。因此，總結其適應證尚無大量數據和研究支撐，但不可否認其具有相當的臨床價值，應進行進一步探索。

綜上所述，IMSI可在更高倍數顯微鏡下選出形態和運動功能更好的精子，對于精液參數顯著異常、反復ICSI失敗的患者可顯著提高胚胎受精率、臨床妊娠率，并降低流產率。由于IMSI儀器價格比較昂貴、觀察時間長、技術成本高、人員培訓難度較大，尚未廣泛推廣。本例患者2個周期、多次移植未孕，最終通過IMSI成功妊娠，推測IMSI可作為梗阻性無精子癥患者嘗試助孕的有效方法。本例患者是單一案例，偶然性較大，目前已有多個國家開展IMSI研究，未來需更多的臨床研究繼續探討IMSI的臨床應用范圍和價值。