輪狀病毒感染對乳鼠腸道菌群及小腸屏障功能的影響

陸恒章，于美玲，程美慧，劉洋，劉長城，趙微

（錦州醫科大學基礎醫學院實驗動物教研室，遼寧 錦州 121000）

輪狀病毒是一種雙鏈RNA病毒，屬于呼腸弧病毒屬（Reoviridae），是嬰幼兒腹瀉的主要病因［1］。腸道病毒感染能夠導致宿主的腸道黏膜屏障功能破壞，改變腸道通透性，從而造成腹瀉癥狀；腸道病毒感染也可改變腸道微生物的組成和活性，如脊髓灰質炎病毒［2］、呼腸孤病毒［3］、諾如病毒［4］和鼠輪狀病毒［5］，可影響腸道微生物群落，導致宿主腹瀉。腸道菌群的改變主要表現為厭氧菌的減少、需氧菌的相對增多及腸道微生物多樣性顯著降低［6-7］。

本研究擬通過16S rDNA測序法檢測乳鼠感染輪狀病毒后腸道菌群的組成、微生物差異性及菌群特征，通過實時熒光定量PCR檢測乳鼠腹瀉模型腸道黏膜屏障功能相關基因的表達及腸道通透性的改變，從而探討輪狀病毒感染后腸道菌群結構的改變與腸道黏膜屏障功能的關系。為進一步了解腸道菌群與輪狀病毒感染之間的相互作用，預防和治療輪狀病毒感染提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級昆明系小鼠由錦州醫科大學實驗動物中心提供（ScXK［遼］2019-0003）。飼養在SPF級動物實驗室內，自由飲食水，環境溫度22.2 ℃，濕度40%～70%，12 h光暗循環（SYxK［遼］2019-0007）。所有操作均符合錦州醫科大學實驗動物倫理委員會的實驗動物倫理要求（審批號：2019014）。

輪狀病毒SA11株由錦州醫科大學病原生物學教研室提供。TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）購 自大連TaKaRa公司；異硫氰酸熒光素-葡聚糖（fluorescein isothiocyanate-dextran，FITC-dextran）購自美 國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 輪狀病毒感染乳鼠腹瀉模型的建立：采用清潔級昆明系小鼠10窩，同窩繁育，每窩飼養雌性6只和雄性1只，合籠21 d后隨機獲得乳鼠20窩（乳鼠雌雄不拒），將20窩乳鼠隨機分為為輪狀病毒感染（RV）組與對照（NC）組，10窩/組。每窩8～12只乳鼠與1只哺乳期母鼠飼養于單獨通風的IVC籠中。乳鼠5日齡時體質量約為8～9 g。乳鼠出生后第1天記為1日齡。待乳鼠4～5日齡后開始實驗。實驗組每天每只乳鼠灌胃1×107病毒感染熒光灶個數（fluorescent focus unit，FFU）/mL的SA11株輪狀病毒100 μL；對照組每天每只乳鼠灌胃PBS 100 μL，連續灌胃4 d，每天觀察乳鼠排便情況。

1.2.2 實驗動物的處理及樣品的收集與保存：所有乳鼠連續灌胃4 d后（即實驗組出現最嚴重腹瀉癥狀時間點）實施頸椎脫臼法處死，在超凈工作臺中，用高壓滅菌的手術器械收集結腸和直腸的混合腸道內容物以及結腸和直腸組織，置于無菌EP管中，立即置于-80 ℃凍存。

1.2.3 乳鼠糞便DNA提取和PCR擴增：根據QIAamp糞便DNA迷你提取試劑盒（美國Qiagen公司）說明書操作，從混合腸道內容物中提取基因組DNA。利用引物341F（5’ -CCTACGGGRSGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3’）擴增細菌16s核糖體RNA基因（342F和806R）V3～V4區。PCR程序為：95 ℃3 min，98 ℃20 s，58 ℃15 s，72 ℃20 s，30個循環，72 ℃延長5 min。PCR反應體系為：2×KAPA Library Amplification ReadyMix 15 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 50 ng，加ddH2O至總體積30 μL。2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（美國AXYGEN公司）切膠回收PCR產物。利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計和2%瓊脂糖凝膠電泳進行文庫質檢。

1.2.4 16S rDNA測序及關聯分析：16S rDNA PCR擴增區域為V3～V4區，采用通用引物341F和806R進行PCR擴增。PCR擴增后進行文庫質檢、Qubit進行文庫定量。使用Illumina Miseq PE250進行測序分析。獲得的測序數據進行物種分類和豐度分析，以及α多樣性分析、β多樣性分析。使用LEfSe在屬水平上選擇差異物種，行Spearman相關性分析，繪制差異物種與檢測因子的相關性熱圖。

1.2.5 乳鼠結直腸糞便RNA提取及cDNA合成：稱取各組結腸和直腸組織0.1 g于1.5 mL離心管中，加入0.9 mL PBS緩沖液，加入5～10顆瓷珠后，置于珠式樣品研磨器中研磨2 min。取250 mL組織研磨液于新的1.5 mL離心管中用于RNA提取。采用TRIzol法提取RNA，并反轉錄合成cDNA，-20 ℃保存。反轉錄反應體系：RNA提取液10 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1 μL，Gene Specific Primer 5 pmol，5×PrimeScript Buffer 4 μL，加ddH2O至總體積為20 μL，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.2.6 實時熒光定量PCR測定病毒基因拷貝數及緊密連接蛋白基因的表達：

1.2.6.1 病毒基因拷貝數檢測 擴增SA11衣殼蛋白VP6特異性基因并繪制標準曲線VP6基因引物序列如表1所示。擴增產物164 bp。擴增產物純化回收，構建標準質粒，檢測標準質粒濃度為290.5 ng/μL。10倍梯度稀釋標準品質粒，每個樣品重復3次，以Ct值為橫坐標，lg基因拷貝數為縱坐標，繪制標準曲線。計算標準質粒DNA基因拷貝數（copies/mL）=6.02×1023/mol×質粒濃度（g/mL）/分子量（MWg/mol）。

表1 PCR引物Tab.1 Primer sequences

1.2.6.2 緊密連接蛋白基因表達檢測 根據小鼠腸道細胞緊密連接蛋白1（tight junction protein 1，TJP-1）、緊密連接蛋白4（claudin-4）、連接黏附分子（F11 receptor，F11R）基因設計特異性引物，以小鼠Gapdh為內參基因，引物序列見表1。實時熒光定量PCR的具體步驟按照TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）說明書操作，設3組重復。根據溶解曲線的結果判斷設計的引物是否可行，采用2-ΔΔCt計算相對定量。

1.2.7 乳鼠腸道通透性檢測：連續灌胃4 d后，NC組和RV組各取2～3只乳鼠于單獨籠中斷食8～10 h后，分別給乳鼠灌胃FITC-dextran 0.6 mg/g，6 h后麻醉，將乳鼠置于動物活體成像儀中，在激發波長485 nm、發射波長535 nm下觀察乳鼠腸道通透性。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，數據以±s表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法（least-significant difference，LSD）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 輪狀病毒感染乳鼠腹瀉模型檢測

連續灌胃4 d后，可觀察到RV組乳鼠水樣腹瀉，糞便呈黃色；而NC組乳鼠無腹瀉。實時熒光定量PCR檢測結果如表2、圖1所示，RV組輪狀病毒SA11毒株VP6基因的拷貝數于感染第4天達頂峰（1.32×109copies/mL）。

圖1 輪狀病毒感染后1～7 d乳鼠糞便樣本中輪狀病毒拷貝數Fig.1 Copy number of rotavirus in stool samples 1 to 7 days after rotavirus infection

表2 病毒拷貝數Tab.2 Number of virus copies

2.2 乳鼠腸道內容物16S rDNA測序分析

2.2.1 α多樣性指數分析和β多樣性分析：在Illumina MiSeq PE250平臺上運行并按方法進行質量過濾后，所有樣本共生成1 182 607條reads，根據Alpha多樣性分析，兼顧測序飽和度和樣品完整性，對每個樣品隨機抽取47 504條reads。根據各樣本的操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）計數，對樣本序列多樣性和豐富度進行評價，NC組與RV組實際觀測到的OTU數量用observed_species指數比較，2組的OTU數量存在統計學差異（P=0.034），見圖2A。為了比較2組細菌群落組成的差異，利用Adonis分析微生物群落結構的差異。采用Unweighted_UniFrac未加權比較2組腸道內容物細菌組成，結果如圖2B所示，2組有明顯的分離（Adonis檢驗P=0.001，R2=0.192）。RV組與NC組的細菌組成有顯著差異。

圖2 組間α多樣性分析和β多樣性分析Fig.2 α diversity analysis and β diversity analysis between groups

2.2.2 物種分類與相對豐度分析和顯著性差異分析：根據物種注釋結果，在屬水平對樣品內的豐度進行分析，結果如圖3A所示，與NC組相比，RV組乳酸桿菌（Lactobacillus）豐度（36.29%）、幽門螺桿菌（Helicobacter）豐度（0%）、梭桿菌（Fusobacterium）豐度（4.74%）均減少，志賀氏菌（Shigella）豐度（43.48%）增加。在屬水平上對所有物種進行分析，如表3所示，未發現未通過P值篩選的物種，經Wilcoxon秩和檢驗，RV組與NC組間有10個屬存在明顯差異。2組之間屬水平的顯著差異如圖3所示，NC組的優勢屬為Lactobacillus、Paenibacillus、Brevundimonas、Parabacteroides、Bacteroides和Alloprevotella，而RV組的富集屬為Enterococcus和Shigella。

圖3 樣品組成多樣性分析及顯著性差異分析Fig.3 Analysis of sample composition diversity and significant difference

表3 乳鼠RV感染后的差異性菌屬Tab.3 Differential bacteria genera after RV infection in suckling mice

2.3 RV感染后乳鼠TJP-1、claudin-4和F11R基因表達情況

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，與NC組相比，RV組claudin-4基因相對表達量（5.41±0.47）增加了448%（P＜ 0.001）、F11R基因（4.46±1.44）增加了541%（P＜ 0.001），而TJP-1基因（0.46±0.08）降低了56%（P＜ 0.001），表明輪狀病毒感染后乳鼠腸道黏膜屏障功能發生了改變。

2.4 Spearman相關性分析

Spearman與檢測因子的相關性分析結果如圖4所示，F11R基因的表達與短單胞菌屬和擬桿菌屬呈負相關；claudin-4基因的表達與短單胞菌屬呈負相關；TJP-1基因的表達與短單胞菌屬呈正相關。

圖4 差異物種與檢測因子的相關性分析Fig.4 Correlation analysis between different species and detection factors

2.5 乳鼠腸道通透性變化

如圖5所示，RV組腸通透性明顯增加，FITC-dextran通過腸上皮細胞進入血液，導致乳鼠腸道外的部位出現熒光，NC組FITC-dextran則無法通過腸上皮而聚集在腸道中。

圖5 動物活體成像儀下觀察腸道通透性熒光圖Fig.5 Fluorescence image of intestinal permeability observed by in vivo animal imager

3 討論

輪狀病毒是引起兒童腹瀉最常見的病原體，腸道病毒進入人體后會先與微生物群接觸，故微生物群的組成可能影響輪狀病毒感染［8］。研究［9-10］顯示，感染了輪狀病毒的嬰兒腸道微生物多樣性低于健康兒童。關于腸道微生物組成與輪狀病毒之間的相互作用關系的研究仍然比較少。本研究結果顯示，輪狀病毒感染組乳鼠腸道菌群多樣性低于NC組，因此，推測腸道微生物群在腹瀉相關過程中發揮了重要作用。

緊密連接主要位于上皮細胞頂端表面，是上皮細胞間連接最為重要的結構復合物，在維持腸黏膜的屏障功能方面發揮重要作用［11］。目前有多種蛋白已經被證實參與了緊密連接的形成，包括claudin、TJP、OCLN、F11R和ZO家族。緊密連接蛋白常被用作觀察腸道緊密連接屏障功能和通透性的指標［12］。本研究中，輪狀病毒感染后，乳鼠TJP-1基因的表達顯著下降。TJP-1作為調控細胞緊密連接的關鍵因子，具有連接細胞間屏障和調節肌動蛋白的作用，可增強細胞間連接［13］。TJP-1低表達可破壞細胞的緊密連接，導致病原體和其他物質進入腸腔引起腹瀉［14］。本研究還發現，短單胞菌屬的多樣性與TJP-1的表達具有顯著的相關性。研究［15-16］表明，短單胞菌屬會在宿主免疫功能降低時作為機會病原體感染宿主，提示可能是輪狀病毒感染影響了乳鼠TJP-1的表達，導致短單胞菌屬多樣性增加。

claudin-4是緊密連接蛋白家族成員之一，參與保持正常組織細胞之間的緊密連接。claudin-4蛋白在細胞膜表面異常表達，可能引起細胞極性破壞，細胞間的連接變松散，細胞間黏附力下降［17］，進而破壞腸道屏障功能。而F11R基因編碼F11受體蛋白，也稱連接黏附因子（iunctional adhesion molecule，JAM-A），是免疫球蛋白超家族成員，是參與細胞緊密連接的跨膜蛋白，通過調節上皮通透性、炎癥和增殖來維持腸道內環境的動態平衡［18］。有研究［19］表明，呼腸孤病毒能通過F11R進入感染內皮細胞，從而增強呼腸孤病毒的傳播。同樣，本研究發現輪狀病毒感染后乳鼠claudin-4和F11R基因表達水平顯著升高，表明claudin-4和F11R表達的增加可能會影響腸道黏膜屏障的功能，但目前這2個基因對腸道黏膜屏障功能的具體作用還存在爭論，需要進一步的研究探索。本研究通過Spearman相關性分析發現，短單胞菌屬及擬桿菌屬的多樣性與claudin-4和F11R表達的增加呈負相關，表明這2種基因表達可能還影響了短單胞菌屬和擬桿菌屬的多樣性。

綜上所述，本研究發現了輪狀病毒感染前后乳鼠腸道內10種顯著差異菌屬，檢測了改變腸道黏膜屏障功能相關基因TJP-1、claudin-4和F11R的表達變化情況。并發現短單胞菌屬和擬桿菌屬與TJP-1、claudin-4和F11R的表達存在一定的相關性。通過對病毒感染后腸道微生物群落的深入挖掘，對輪狀病毒微生態制劑的研發及臨床應用、輔助臨床腹瀉的預防和治療具有一定意義。同時深度剖析影響病毒復制的腸道共生菌，為篩選診治病毒感染的靶點提供了新的思路。