白蛋白結合型紫杉醇誘導大鼠神經病理性疼痛的作用機制

陳秀蘭，劉淑娟，蘇烏云，閆海成，竇佳，李志偉，王薇

（1.內蒙古醫科大學研究生學院，呼和浩特 010107；2.內蒙古醫科大學附屬醫院腫瘤內科，呼和浩特 010051；3.內蒙古醫科大學附屬醫院神經外科，呼和浩特 010051；4.內蒙古鄂托克旗第二人民醫院急診科，內蒙古 鄂托克旗 016064）

白蛋白結合型紫杉醇（albumin-bound paclitaxel，Nab-PTX）是一種新型的紫杉醇制劑，已被廣泛應用于多種實體腫瘤的治療。該藥抗腫瘤作用很強，但有較重的神經毒性，會引發周圍神經病變（chemotherapy-induced neuropathic pain，CINP），患者常表述手足麻木和疼痛燒灼感，嚴重時可導致治療中斷。迄今為止，尚無有效的預防和治療方法。研究［1-2］表明，神經系統的非神經元成分可能參與了CINP的產生，這為該疾病治療的發展提供了新的靶點。

星形膠質細胞和小膠質細胞是中樞神經系統中介導先天免疫的主要細胞，通過表達的病原模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）感 知受損細胞釋放的病原體衍生物或內源性配體，并啟動先天免疫反應。Toll樣受體家族（Toll-like receptors，TLRs）是第一個被識別的PRRs［3］。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是TLR家族中被研究最多的成員，在脊髓背根神經節（dorsal root ganglia，DRG）和膠質細胞中表達增加，可調節脊髓損傷或慢性疼痛誘導的中樞致敏的膠質細胞活化和脊髓中炎癥介質的釋放［4］。TLR4通過激活NF-κB通路來誘導促炎細胞因子的釋放，參與痛覺過敏和異常性疼痛的形成［5］。研究［6］發現TLR4介導的信號通路驅動神經膠質激活及炎癥反應，但其在Nab-PTX引起CINP中的作用和機制尚不清楚，本研究旨在探究Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛中TLR4/NF-κB信號通路、脊髓膠質細胞和炎性細胞因子的表達變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級成年雄性SD大鼠30只（300～350 g），購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。隨機分為Nab-PTX 4 mg/kg組、Nab-PTX 6 mg/kg組及對照組，每組10只。飼養條件：房間的溫度和濕度均為恒定（溫度20～26 ℃，濕度40%～70%），所有動物都在每日標準的光照7：00～19：00中飼養，自由攝食和飲水。所有動物實驗程序均按照國際疼痛研究協會的指導方針進行，并獲得動物護理和使用委員會批準。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器

1.2.1 實驗藥物及試劑：注射用Nab-PTX購自石藥集團歐意藥業有限公司（產品批號：B042003269）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）試劑盒（江蘇酶免實業有限公司）；GFAP（北京博奧森生物技術有限公司）；Iba-1、Rabbit Anti TLR4、Mouse Anti P65（美國萊恩生物科技有限公司）；山羊抗兔 IgG cy3（愛博泰克生物技術有限公司）；Trizon Reagent、超純RNA提取試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH、辣根酶標記山羊抗鼠IgG（H+L）、辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（北京中杉金橋生物技術有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；Marker（賽默飛世爾科技公司）。

1.2.2 儀器：ZH-200熱刺痛儀（安徽正華生物儀器設備有限公司）；Von Frey纖毛機械刺激針（上海玉研科學儀器有限公司）；熒光PCR儀（伯樂生命醫學產品有限公司）；蛋白垂直電泳儀、全自動酶標儀（北京市六一儀器廠）；熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 一般情況觀測

觀察大鼠一般健康狀況，飲食、腹瀉、毛發，運動情況，測定體質量變化。

1.4 構建Nab-PTX化療后大鼠神經病理性疼痛模型

大鼠適應性飼養1周，參照YAMASHITA等［1］和SUN等［2］報道的Nab-PTX給藥劑量，Nab-PTX給藥組（Nab-PTX 6 mg/kg組和4 mg/kg組）分別于第1、8、15天腹腔注射給藥，連續給藥3次；對照組給予相同劑量的0.9%生理鹽水。分別于給藥前及給藥后不同時間點檢測各組大鼠體質量，同時分別于第0、5、7、11、14、18、21、25、28、32、35天檢測各組大鼠機械縮足反射閾值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）及熱縮足反射潛伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）。行為學測定和藥物注射都在白天（9：00～17：00）進行。

1.5 行為學測試

1.5.1 PWMT的測定：在安靜環境中適應約30 min，將大鼠足底接觸于帶金屬網底的有機玻璃籠內，按升序（1、2、4、6、8、10、15和26 g）逐漸增強的力度將校準的 von Frey絲施加到左后足表面的中央皮膚5次，保持6～8 s，每次間隔15 s。當后爪在連續 5 次應用中有 4 次從特定長絲中迅速縮爪或舔足為陽性反應，即為大鼠的PWMT［7］。

1.5.2 PWTL：采用熱刺痛儀照射光束穿過透明的玻璃板，光束直接照射大鼠的左后足，會引起迅速縮足或者舔腳等抬腳動作，記錄從光束照射開始到抬腳停止照射持續的時間，每側重復照射5次，每次照射間隔15 min，取平均數，即為大鼠的PWTL［8］。

1.6 組織取材

在實驗第1、8、15天腹腔注射Nab-PTX，于第21天檢測到大鼠PWMT最低值，故于第21天將大鼠處死，取各組大鼠脊髓腰膨大處組織。

1.7 檢測方法

1.7.1 ELISA 檢測：采用雙抗體夾心法，分光光度計讀數均使用酶標儀進行。標準曲線計算脊髓組織中炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平。所有實驗重復 3 次。

1.7.2 免疫熒光檢測：取出大鼠脊髓組織，培養皿內滴加足夠量的稀釋好的一抗GFAP、Iba-1，4 ℃ 冰箱孵育過夜，次日用PBS浸洗培養皿3次，每次3 min，移液槍吸干培養皿內多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗CY3（1∶200），濕盒中37 ℃孵育30 min，PBS浸洗切片3次，每次5 min；最后滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，用PBS沖洗多余的DAPI，自來水沖洗1 min。吸水紙吸干玻片上的液體，含抗熒光淬滅劑的封片液封片。在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.7.3 實時PCR檢測：取出大鼠脊髓組織，使用TRIzol Reagent，提取RNA且測定濃度后，逆轉錄得到mRNA，再測定相對表達量，后進行實時PCR，反應體系如 下：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL；上游引物0.4 μL；下游引物0.4 μL；cDNA 1 μL；補充RNase Free dH2O 8.2 μL，反應總體積為20 μL，擴增條件：95 ℃變性10 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；共需要40個循環。內參為β-actin，使用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。其中Stem-loop primer為引物設計時一起合成，見表1。

表1 相關引物序列Tab.1 Primer sequences

1.7.4 Western blotting檢測：取出大鼠脊髓組織，剪取樣品置于離心管內，加入RIPA細胞裂解液勻漿。高速離心機12 000 r/min 離心10 min。取上清液至新的EP管（BCA測定），棄沉淀。繪制標準曲線，測定蛋白濃度，配置SDS-PAGE膠，行蛋白電泳，后用300 mA恒流轉膜1.5 h。用PVDF膜孵育一抗過夜，次日PVDF膜室溫孵育二抗2 h，洗膜，顯影成像。

1.8 統計學分析

采用統計學軟件SPSS 22.0進行統計分析。計量資料以±s表示。行為學數據的分析采用重復測量方差分析（Repeated-Measure ANOVA），同一時間點組間比較采用Bonferroni檢驗；ELISA、免疫熒光、實時PCR、Western blotting等數據采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和Bonferroni檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物一般狀況及體質量變化

在腹腔注射前，Nab-PTX給藥組與對照組體質量無統計學差異。于第1、8、15天腹腔注射Nab-PTX后，與對照組相比，Nab-PTX 6 mg/kg組、4 mg/kg組體質量下降，但無統計學差異。給予Nab-PTX后，大鼠出現輕中度不良反應，如腹瀉、戧毛、乏力、攝食減少、運動遲緩，體質量下降等，考慮為化療藥物引起的不良反應。見圖1。

圖1 Nab-PTX對大鼠體質量的影響Fig.1 Effect of Nab-PTX on the body mass of rats

2.2 行為學變化測定結果

2.2.1 PWMT的測定結果：在腹腔注射前，Nab-PTX給藥組與對照組PWMT無統計學差異。于第1、8、15天腹腔注射Nab-PT X，與對照組相比，Nab-PTX給藥組左后足PWMT均呈逐漸下降趨勢，于給藥后第21天，Nab-PTX給藥組大鼠PWMT降至最低點（P＜ 0.05）。隨著停藥時間的延長，Nab-PTX給藥組PWMT逐漸回升，至第35天PWMT逐漸恢復。Nab-PTX給藥組PWMT之間無統計學差異，表明Nab-PTX可誘發大鼠機械刺激痛覺超敏。見圖2。

圖2 Nab-PTX給藥組和對照組PWMT變化Fig.2 Change in PWMT in the Nab-PTX and control groups

2.2.2 PWTL的測定結果：給藥組于第1、8、15天腹腔注射Nab-PTX，與對照組相比，給藥組左后足PWTL均呈逐漸下降趨勢；給藥后第18天，Nab-PTX給藥組大鼠PWTL值呈最低值（P＜ 0.05）；隨著停藥時間的延長，Nab-PTX給藥組PWTL逐漸恢復，至給藥后第35天PWTL基本恢復正常。Nab-PTX給藥組PWTL之間無統計學差異，表明Nab-PTX可誘發大鼠熱輻射痛覺過敏反應。見圖3。

圖3 Nab-PTX給藥組和對照組大鼠PWTL變化Fig.3 Change in PWTL in the Nab-PTX and control groups

2.3 Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛大鼠脊髓中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的表達

ELISA法檢測結果顯示，腹腔注射Nab-PTX后，Nab-PTX 6 mg/kg組和4 mg/kg組TNF-α、IL-6和IL-1β表達水平與對照組相比顯著上調，差異均有統計學意義（P＜ 0.05），然而IL-10表達水平無統計學差異；Nab-PTX 6 mg/kg組與4 mg/kg組之間TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10表達均無統計學差異。證實了炎性細胞因子參與Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛的脊髓炎癥反應。見表2。

表2 Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛大鼠脊髓中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10蛋白水平（±s，pg/mL，n=10）Tab.2 Protein levels of TNF-α，IL-6，IL-1β，and IL-10 in the spinal cord of rats with neuropathic pain induced by Nab-PTX（±s，pg/mL，n=10）

表2 Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛大鼠脊髓中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10蛋白水平（±s，pg/mL，n=10）Tab.2 Protein levels of TNF-α，IL-6，IL-1β，and IL-10 in the spinal cord of rats with neuropathic pain induced by Nab-PTX（±s，pg/mL，n=10）

2.4 Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛大鼠脊髓中GFAP和Iba-1的激活情況

免疫熒光檢測結果顯示，腹腔注射Nab-PTX后，Nab-PTX 6 mg/kg組與4 mg/kg組GFAP和Iba-1表達均升高；與對照組GFAP和Iba-1表達（分別為0.01±0.01和0.03±0.04）相比，Nab-PTX 6 mg/kg組GFAP和Iba-1表達（0.30±0.39和0.19±0.14）有統計學差異（P＜0.05），而Nab-PTX 4 mg/kg組GFAP和Iba-1表達（0.21±0.12和0.05±0.07）無統計學差異；Nab-PTX 6 mg/kg組與4 mg/kg組之間GFAP表達無統計學差異；而Nab-PTX 6 mg/kg組與4 mg/kg組之間Iba-1表達有統計學差異（P＜ 0.005）。證實了Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛大鼠脊髓中星形膠質細胞和小膠質細胞均被激活。見圖4、5。

2.5 Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛大鼠脊髓中TLR4和NF-κB p65的mRNA水平的表達

圖5 Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛大鼠脊髓中GFAP和Iba-1的表達Fig.5 GFAP and Iba-1 expression in the spinal cord of rats with Nab-PTX-induced neuropathic pain

實時PCR檢測結果顯示，腹腔注射Nab-PTX后，Nab-PTX 6 mg/kg和4 mg/kg大鼠脊髓中TLR4和NF-κBp65的mRNA水平均上調。Nab-PTX 6 mg/kg組TLR4和NF-κB p65的mRNA水平（分別為2.5±0.13和2.22±0.20）與對照組（均為1.00±0.00）及Nab-PTX 4 mg/kg組（1.47±0.30和1.46±0.30）相比均顯著上調（P＜ 0.01），然而Nab-PTX 4 mg/kg組與對照組TLR4和NF-κB p65的mRNA水平相比無統計學差異。證明腹腔注射Nab-PTX后，增加了大鼠脊髓組織中TLR4和NF-κB p65mRNA水平的表達。見圖6。

圖6 Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛中大鼠脊髓TLR4和NF-κB p65的mRNA的相對表達水平Fig.6 Relative expression of TLR4 and NF-κBp65 mRNA in the spinal cord of rats with Nab-PTX-induced neuropathic pain

2.6 Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛大鼠脊髓中TLR4和NF-κB p65蛋白水平的表達

Western blotting檢測結果顯示，腹腔注射Nab-PTX后，Nab-PTX 6 mg/kg組和4 mg/kg組大鼠脊髓中TLR4和NF-κB p65蛋白表達水平均增加。與對照組TLR4和NF-κB p65蛋白表 達（分別為0.09±0.03和0.28±0.04）相 比，Nab-PTX 6 mg/kg組TLR4和NF-κB p65蛋白表達（0.26±0.05和0.66±0.05）差異有統計學意義（P＜ 0.05），而Nab-PTX 4 mg/kg組TLR4和NF-κB p65蛋白表達（0.20±0.06和0.31±0.05）無統計學差異；Nab-PTX 6 mg/kg組與4 mg/kg組之間TLR4蛋白表達無統計學差異，而NF-κB p65蛋白表達差異有統計學差異（P＜ 0.05）。證明腹腔注射Nab-PTX后，增加了大鼠脊髓組織中TLR4和NF-κB p65蛋白的表達水平。見圖7。

圖7 Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛大鼠脊髓中TLR4和NF-κB p65的蛋白表達水平Fig.7 Protein expression of TLR4 and NF-κB p65 in the spinal cord of rats with Nab-PTX-induced neuropathic pain

3 討論

本研究結果顯示，藥物模型組PWMT和PWTL顯著降低，表明Nab-PTX可誘導大鼠機械刺激痛覺超敏和熱輻射痛覺過敏。同時發現Nab-PTX引起的神經病理性疼痛，隨藥物的停用逐漸消失。其次，在Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛大鼠模型中，大鼠脊髓小膠質細胞和星形膠質細胞激活、TLR4/NF-κB p65信號通路上調以及炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌增加。這些結果表明Nab-PTX在脊髓中引起明顯的病理變化，這些可能是導致該藥物引起神經病理性疼痛的原因之一。

目前研究［9］均在探索CIPN的確切機制及其最佳治療方法，在疼痛的背景下，脊髓星形膠質細胞和小膠質細胞活化之間存在重要差異。然而，在Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛動物模型中，GFAP、Iba-1均明顯的激活，提示星型膠質細胞和小膠質細胞均參與了Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛，并且與藥物濃度相關。研究［10］表明，中樞神經系統中的細胞因子失調與多種神經病理性疼痛有關。本研究中證實了炎性細胞因子參與Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛的脊髓炎癥反應，這與研究中［11］報道的CIPN產生炎性細胞因子作用相同。因此，抑制促炎細胞因子的產生可能成為減輕Nab-PTX誘導的神經性疼痛的潛在靶點。

近年來，關于TLR4在神經病理性疼痛等免疫炎癥性疾病中的作用引起了廣泛關注，在免疫炎癥應答和神經病理性疼痛之間起重要連接作用［12］。TLR4 的活化最終表現在激活NF-κB，促進炎性細胞因子的合成與分泌和啟動獲得性免疫應答［13-14］。本研究結果顯示，TLR4/NF-κB參與了Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛，從而釋放促進疼痛行為的促炎細胞因子合成與分泌。

本研究成功構建Nab-PTX誘導的神經病理性疼痛大鼠模型，觀察了大鼠疼痛行為學變化及脊髓GFAP、Iba-1、TLR4、NF-κB p65及炎性細胞因子表達的變化。本研究結果顯示，Nab-PTX引起神經病理性疼痛的同時，可誘發星形膠質細胞和小膠質細胞激活、TLR4、NF-κB p65信號通路上調及炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β分泌增加，并且與藥物劑量相關。對上述通路及靶點進行調節，有望找到一種新的神經病理性疼痛治療手段，改善Nab-PTX化療引起的神經病理性疼痛患者的臨床預后，為其治療以及藥物篩選提供新的研究方向。