阿爾茨海默病小鼠模型中TRPC3通過上調(diào)ZO-1和LRP-1蛋白表達清除β淀粉樣蛋白沉積

張舒蕾，張麗艷，李珍慧，安一鳴，高翔宇

（沈陽醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院病理生理學教研室，沈陽 110034）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）屬于神經(jīng)退行性疾病，臨床上以認知功能障礙、人格改變和學習記憶能力進行性減退為主要表現(xiàn)。其發(fā)病機制復雜，相關(guān)學說眾多，如β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）級聯(lián)假說、血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）受損學說、tau蛋白學說、氧化應(yīng)激學說、膽堿能損傷學說、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)假說等［1］。目前Aβ級聯(lián)假說占主導地位，該學說認為Aβ在腦內(nèi)異常沉積是引起患者認知功能障礙的主要原因。過多的Aβ引起神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成的同時還會激活小膠質(zhì)細胞，影響突觸功能，出現(xiàn)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等，這些反應(yīng)又會進一步促進Aβ在腦內(nèi)沉積，形成特殊的級聯(lián)式放大效應(yīng)［2］。

經(jīng)典瞬時受體電位通道3（transient receptor potential canonical 3，TRPC3）是瞬時受體電位家族中的一個亞型，廣泛表達于平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，特別是腦海馬中。TRPC3主要通過調(diào)節(jié)鈣離子穩(wěn)態(tài)，維持細胞內(nèi)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的鈣離子水平，影響神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)和功能，調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性和突觸的控制［3］。本課題組前期研究［4］發(fā)現(xiàn)，AD模型中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子可通過上調(diào)TRPC3表達，減輕腦海馬區(qū)的Aβ沉積，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用，從而改善AD小鼠認知功能。Aβ的清除主要有經(jīng)BBB轉(zhuǎn)運出腦、細胞吞噬和Aβ降解酶降解3種途徑［5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)，正常生理狀況下腦間質(zhì)液中Aβ的濃度是血液中的6倍，通過BBB將Aβ轉(zhuǎn)運至有強大清除能力的外周血液，是其最主要、最快速的清除路徑。BBB對Aβ的高效轉(zhuǎn)運性能主要與腦微血管內(nèi)皮細胞表面存在的Aβ轉(zhuǎn)運受體，如低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（low density lipoprotein receptor-related protein-1，LRP-1）、P糖蛋白（permeability glycoprotein，P-gp）、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（advanced glycation end product receptor，RAGE）等密切相關(guān)，同時還與血管壁完整性、配體親和力和競爭力相關(guān)［7］。BBB功能障礙會影響Aβ的正常轉(zhuǎn)運，從而導致Aβ沉積。同時，Aβ沉積會破壞腦微血管內(nèi)皮細胞和緊密連接相關(guān)蛋白，導致BBB喪失完整性［8］。由此可見，BBB功能障礙和Aβ沉積可相互作用，共同促進疾病進展。本研究利用Aβ誘導AD小鼠模型，內(nèi)源性激活和抑制TRPC3，通過檢測小鼠的行為學改變、BBB通透性和功能變化、Aβ轉(zhuǎn)運受體LRP-1表達情況、腦組織和血清中Aβ濃度，探討TRPC3清除Aβ沉積的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和分組：60只5周齡雄性費城癌癥研究所小鼠（購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司），體質(zhì)量24～27 g，采用隨機分組原則，分為假手術(shù)組、模型組、二酰基甘油類似物（1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol，OAG）組、吡唑化合物［ethyl-1-（4-（2，3，3-trichloroacrylamide）phenyl）-5-（trifluoromethyl）-1H-pyrazole-4-carboxylate，Pyr3］組，每組15只。腹腔注射3.5%水合氯醛（0.1 mL/10 g）麻醉小鼠，模型組、OAG組和Pyr3組小鼠側(cè)腦室注射Aβ1-42（410 pmol/3 μL），誘導AD小鼠模型，注射位置在腦中線向右1.1 mm、前囟后0.5 mm處，微量注射器注射深度3 mm，速度為0.6 μL/min，留針5 min。假手術(shù)組小鼠側(cè)腦室注射等量滅菌生理鹽水。同天，OAG組和Pyr3組小鼠分別腹腔注射TRPC3的特異性激動劑OAG（0.6 μg/g）和TRPC3的特異性抑制劑Pyr3（0.1 μg/g），1次/d，連續(xù)21 d，以上調(diào)和下調(diào)TRPC3的表達。

1.1.2 主要試劑：Aβ1-42（英國Abcam公司）；OAG、Pyr3（美國Cayman公司）；緊密連接蛋白-1（zonula occluden-1，ZO-1）抗體（美國Affinity公司）；鼠Aβ1-42蛋白抗體（英國Abcam公司）；LRP-1蛋白抗體、β-actin小鼠單克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP、羊抗小鼠IgG-HRP（中國Boster生物公司）；伊文思藍（Evans blue，EB，上海伊卡生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宮實驗：造模后第16天開始，持續(xù)6 d檢測小鼠的學習和記憶能力。圓形水池等距離分為4個象限，裝滿黑色墨水，水溫（25±1）℃。進行定位航行實驗，在第3象限內(nèi)設(shè)置1個圓形平臺，隱藏在水位下約1 cm處，將小鼠面壁，于不同象限放入池內(nèi)，記錄小鼠上臺時間，最長為60 s，若在60 s內(nèi)未找到平臺，則用木棒引導至平臺上并停留5 s，3次/d。進行空間探索實驗，將平臺移走，記錄小鼠在60 s內(nèi)目標象限停留時間、穿越平臺次數(shù)。

1.2.2 EB染色測定BBB通透性：EB是一種經(jīng)典的BBB示蹤劑，可進行BBB通透性的定量、定性測定［9］。小鼠尾靜脈注射2% EB（0.1 mL/10 g），2 h后染料在小鼠體內(nèi)充分循環(huán)，小鼠眼周、鼻唇、四肢等淺表皮膚呈藍色。水合氯醛麻醉小鼠，用肝素化生理鹽水心臟灌流，直到小鼠右心房流出清亮透明液體。取腦組織，稱重后置于3 mL甲酰胺中，60 ℃恒溫水浴24 h，4 000 r/min離心15 min，取上清液比色，酶標儀檢測波長為620 nm的吸光度。根據(jù)不同濃度標準品的吸光度繪制標準曲線，計算腦組織EB含量。

1.2.3 Western blotting檢測ZO-1蛋白表達：緊密連接受損時BBB通透性增加，ZO-1是目前公認的檢測BBB通透性和功能的可靠指標［10］。小鼠末次給藥2 h后取腦皮質(zhì)，切碎均漿，10 000 r/min離心10 min后取上清液，進行蛋白濃度測定。蛋白緩沖液水浴變性后取30 μL上樣于5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，室溫下垂直電泳2 h，轉(zhuǎn)膜2 h，在搖床上封閉PVDF膜2 h，4 ℃下與ZO-1抗體（1∶1 000稀釋）孵育過夜。第2天再與HRP-羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋）、HRP-羊抗鼠IgG（1∶5 000稀釋）室溫下孵育2 h，ECL顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.4 Western blotting檢測LRP-1蛋白表達：LRP-1主要表達于腦微血管內(nèi)皮細胞的腔外側(cè)，是Aβ的主要轉(zhuǎn)運受體，介導Aβ由腦內(nèi)向血液流出過程［11］。取腦皮質(zhì)，蛋白濃度測定同上。制備聚丙烯酰胺凝膠后每孔上樣20 μL，室溫下垂直電泳2 h，轉(zhuǎn)膜2 h后浸入到5%（M/V）脫脂奶粉溶液中，搖床上封閉2 h，加入LRP-1抗體（1∶3 000稀釋）4 ℃孵育過夜。第2天室溫下與HRP-羊抗兔IgG（1∶2 000稀釋）、HRP-羊抗鼠IgG（1∶1 500稀釋）孵育2 h，ECL顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.5 ELISA測定海馬和血清Aβ1-42濃度：小鼠末次給藥2 h后斷頭取血，分離血清。取腦海馬，勻漿，低溫超速（10 000 r/min）離心10 min后得上清液，進行蛋白濃度測定。按ELISA試劑盒說明書操作，加入標準品、海馬和血清稀釋樣品各100 μL，并加入HRP標記的Aβ1-42檢測抗體4 ℃避光孵育過夜。第2天與TMB顯色試劑混合15 min，加入終止液，可見溶液顏色從藍色變?yōu)辄S色。酶標儀在450 nm測量標準品、樣本吸光度值，繪制標準曲線，計算樣本的Aβ1-42濃度。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 9軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 上調(diào)TRPC3對AD小鼠空間學習和記憶能力有改善作用

水迷宮定位航行實驗發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組第4天、第5天逃避潛伏期明顯延長（P＜0.001）；與模型組比較，OAG組第4天、第5天逃避潛伏期明顯縮短（P＜ 0.05）；Pyr3組與模型組比較，第4天、第5天逃避潛伏期無統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05）。空間探索實驗發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組目標象限停留時間、穿越平臺次數(shù)明顯下降（P＜ 0.001）；與模型組比較，OAG組目標象限停留時間、穿越平臺次數(shù)明顯增加（P＜ 0.05）；Pyr3組與模型組比較，目標象限停留時間、穿越平臺次數(shù)均無統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05）。結(jié)果表明，AD造模成功，TRPC3激動劑對AD小鼠空間學習、記憶能力有改善作用，TRPC3抑制劑對AD小鼠行為學無明顯作用。見表1。

表1 Morris水迷宮實驗結(jié)果Tab.1 Morris water maze experimental results

2.2 上調(diào)TRPC3能恢復AD小鼠BBB通透性

與假手術(shù)組比較，模型組腦組織EB含量增加（P＜ 0.05），BBB通透性增高；與模型組比較，OAG組腦組織EB含量減少（P＜ 0.05），BBB通透性下降；Pyr3組與模型組比較，腦組織EB含量無統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05）。結(jié)果表明，TRPC3激動劑能恢復小鼠BBB通透性。見表2。

表2 各組小鼠EB含量、ZO-1和LRP-1蛋白表達水平、海馬和血清Aβ1-42濃度Tab.2 EB content，expression of ZO-1 and LRP-1 proteins，and Aβ1-42 concentration in the hippocampus and serum in each group

2.3 上調(diào)TRPC3能夠促進BBB緊密連接蛋白ZO-1的表達

與假手術(shù)組比較，模型組ZO-1表達下降（P＜0.01），表明BBB通透性增加、功能受損；與模型組比較，OAG組ZO-1表達增加（P＜ 0.05），表明受損的BBB通透性、功能有所恢復；Pyr3組與模型組比較，ZO-1表達無統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05）。結(jié)果表明，TRPC3激動劑能恢復BBB通透性，改善受損的BBB功能。見表2、圖1。

圖1 Western blotting檢測各組小鼠ZO-1蛋白表達情況Fig.1 Zonula occluden-1 protein expression in each group determined by Western blotting

2.4 上調(diào)TRPC3能夠促進Aβ轉(zhuǎn)運受體LRP-1的表達

與假手術(shù)組比較，模型組LRP-1表達下降（P＜0.01）；與模型組比較，OAG組LRP-1表達增加（P＜0.05）；Pyr3組與模型組比較，LRP-1表達無統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05）。結(jié)果表明，AD小鼠LRP-1表達下降，TRPC3激動劑能促進LRP-1的表達。見表2、圖2。

圖2 Western blotting檢測各組小鼠LRP-1蛋白表達情況Fig.2 Low density lipoprotein receptor-related protein-1 expression in each group determined by Western blotting

2.5 上調(diào)TRPC3可促進腦組織的Aβ1-42向外周血轉(zhuǎn)運

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠海馬和血清的Aβ1-42濃度均升高（P＜ 0.01，P＜ 0.05）；與模型組比較，OAG組小鼠海馬Aβ1-42濃度下降（P＜ 0.05），血清Aβ1-42濃度升高（P＜ 0.05）；與模型組比較，Pyr3組小鼠海馬Aβ1-42濃度無統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05），血清Aβ1-42濃度下降（P＜ 0.01）。結(jié)果表明，上調(diào)TRPC3可減輕腦部Aβ1-42沉積，并促進其向外周血轉(zhuǎn)運。見表2。

3 討論

AD的病理特點為Aβ 在腦內(nèi)異常沉積形成老年斑，tau蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)，海馬等腦區(qū)突觸和神經(jīng)元大量丟失等［12］。Aβ由淀粉樣前體蛋白產(chǎn)生，若出現(xiàn)代謝障礙，Aβ會沉積于腦并產(chǎn)生神經(jīng)毒性，導致患者出現(xiàn)認知功能障礙。因此，找到減少腦部Aβ沉積的方法可能是治療AD的關(guān)鍵。Aβ是一種極性、可溶性大分子物質(zhì)，不能通過自由擴散方式在腦組織和外周血中轉(zhuǎn)換。在Aβ的多種清除機制中，經(jīng)BBB轉(zhuǎn)運出腦是最主要的方式。大量研究表明，Aβ主要通過轉(zhuǎn)運受體清除，如LRP-1、P-gp、RAGE等轉(zhuǎn)運受體均高表達于腦微血管內(nèi)皮細胞。研究［13-14］發(fā)現(xiàn)，AD中LRP-1表達降低；若抑制健康小鼠LRP-1的腦內(nèi)表達，Aβ的外周轉(zhuǎn)運率下降30%。腦微血管內(nèi)皮細胞是BBB的重要組成成分，緊密連接使腦微血管內(nèi)皮細胞形成連續(xù)的單層物理屏障，使跨細胞自由擴散受到抑制，同時還會調(diào)節(jié)離子、復合物在腦內(nèi)流動。ZO-1是緊密連接蛋白中最主要的胞質(zhì)蛋白，在許多神經(jīng)功能障礙疾病中，ZO-1缺乏不僅直接影響緊密連接蛋白構(gòu)成，其水平降低還是BBB損傷的重要標志。

本研究中，模型組EB含量增加，ZO-1、LRP-1表達下降，表明BBB受到破壞，BBB通透性增加，Aβ轉(zhuǎn)運功能降低，Aβ清除不力，海馬和血清的Aβ1-42濃度升高；而OAG組EB含量降低，ZO-1、LRP-1表達增加，表明在TPRC3激動劑的作用下，受損的BBB功能得到改善，BBB通透性降低，Aβ轉(zhuǎn)運功能增強，海馬Aβ1-42濃度降低，Aβ轉(zhuǎn)運到周圍血管，血清Aβ1-42濃度升高。

本課題組前期研究［14］發(fā)現(xiàn)，激活TRPC3表達可減輕腦部Aβ沉積，從而改善AD小鼠認知功能和突觸功能障礙。本研究證明，TRPC3的激活表達，可能通過修復LRP-1等Aβ轉(zhuǎn)運蛋白功能，加速Aβ清除，從而改善小鼠的認知功能。但尚不清楚TRPC3通過何種途徑修復BBB及LRP-1等Aβ轉(zhuǎn)運受體功能，需進行進一步實驗探討。

本研究中，給予TRPC3抑制劑后小鼠海馬Aβ1-42濃度改變不明顯。原因在于AD小鼠模型是通過側(cè)腦室注射高濃度Aβ造模，即使Aβ轉(zhuǎn)運功能受到抑制，海馬Aβ濃度也不會有明顯改變。但肝臟、腎臟等臟器對已通過BBB的Aβ有強大的清除能力，所以給予TRPC3抑制劑后，小鼠血清Aβ1-42濃度相對下降。

綜上所述，本研究表明，激活TRPC3可恢復BBB功能，增加Aβ轉(zhuǎn)運受體LRP-1蛋白表達，進而清除腦組織Aβ沉積，改善AD行為學癥狀。