核桃內種皮脂質和氨基酸組成分析

謝素雅，曹尚橋，李紅波，張小勇，劉振彬，胡梁斌，莫海珍

（1.陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2.中糧工科（西安）國際工程有限公司，陜西 西安 710082）

核桃種植遍布世界各地，我國擁有最大的種植面積和產量。作為重要的堅果樹種和木本糧油樹種，核桃具有很高的生態效益和經濟效益[1]。核桃的全系產業鏈價值十分可觀，但就目前而言，產品的附加值開發程度整體較低。為了提高核桃油的加工品質，在產品加工過程中需要脫掉核桃內種皮（俗稱核桃仁囊衣），有助于改善核桃油脂色澤、消除不良風味，但也意味著核桃內種皮在加工過程中被丟棄而造成資源浪費。

核桃的內種皮是包裹在核桃仁表面的一層薄膜，成熟干制后呈金黃色，有苦澀味[2]。中醫認為，核桃皮可以入藥，也可以泡水。核桃皮的性溫、味苦辛，歸肝、膽、胃經，有養胃健胃、疏肝衛膽、潤通腸胃、治療頑癬、殺蟲止癢的功效，也有一定的補腎潤肺、養身補氣的功效。有研究表明，核桃內種皮總酚含量和抗氧化能力遠高于核桃仁[2-4]。萬政敏等人[5]發現核桃內種皮中富含多種酚酸類物質和黃酮類物質，榮瑞芬等人[6]對核桃內種皮的營養及功能成分（蛋白質、碳水化合物、脂肪等）進行了初步分析，結果表明其中含有較豐富的脂肪和蛋白質。但是目前有關研究僅限于含量測定，對于內種皮中氨基酸及脂質組成尚未深入探討，極大地限制了其產業開發應用及核桃內種皮油脂的深度梯次加工。

以陜西香玲核桃為研究對象，通過分析核桃內種皮中氨基酸的組成、內種皮油脂中脂質成分、脂肪酸及甘油酯的組成，以期為核桃內種皮高值化產品的開發提供理論基礎，減少資源浪費。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：香玲核桃，山東省果樹所1978年雜交育成的早實，產地為陜西延安。

試驗試劑：氯仿、甲醇、濃硫酸、氯化鈉、2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）均為分析純，天津天力化學試劑有限公司提供；正己烷、甲醇均為色譜純，天津科密歐化學試劑廠提供。

1.2 儀器與設備

KQ5200DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；MD200-1型氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司產品；JA2003N型電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司產品；FW-100D型高速萬能粉碎機，天津鑫博得儀器有限公司產品；RE100-Pro型冷凍干燥機，四環福瑞科儀科技發展（北京）有限公司產品；RE100-Pro型旋轉蒸發儀，大龍興創實驗儀器（北京）有限公司產品；GC-MS 6800型氣相色譜質譜聯用儀，江蘇天瑞儀器股份有限公司產品；LCMSMS液 質 聯 用 儀 （Q Exactive Orbitrap LCMSMS），賽默飛世爾科技（中國）有限公司產品；高效液相色譜儀，滕州市滕海分析儀器有限公司產品；HH-S6L型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產品；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理

核桃去殼置于沸水中浸泡一段時間后去皮處理，收集核桃內種皮裝入密封袋放入-80℃冰箱中備用。

1.3.2 蛋白質、脂肪含量測定

蛋白質參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》的方法進行測定，脂肪參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》的方法測定。

1.3.3 氨基酸組成測定

氨基酸組成的測定參照《HRZ/ZDS-GF-015-2020飼料中氨基酸的測定高效液相色譜法》。

1.3.4 核桃內種皮油脂的提取

油脂提取采用Folch J等人[7]的方法稍作修改，將核桃內種皮粉碎后冷凍干燥，溶劑以氯仿∶甲醇∶水=2∶1∶0.75（V/V/V）的比例，樣品和溶劑以1∶15的比例進行制備，其中加入0.005%的BHT做抗氧化處理，超聲波（40 kHz，100 W）輔助萃取20 min，溫度設置為30℃，靜置分層后真空抽濾，去除樣品殘渣后倒入分液漏斗靜置，收集下層溶液進行旋蒸，旋轉蒸發儀溫度設置40℃，每種樣品重復3次萃取，旋蒸后還殘存的有機溶劑用氮吹儀輔助去除得到核桃仁種皮油脂。

1.3.5 脂質組成測定

將100 μL樣品加入到有聚四氟乙烯襯里帽的玻璃離心管中，加入0.75 mL預冷的甲醇，渦旋振蕩。加入2.5 mL預冷的甲基叔丁基醚，在搖床上室溫孵育1 h加入0.625 mL質譜級水混勻，使有機相分層，室溫孵育10 min后，以轉速1 000 r/min離心10 min。收集上層有機相，向下層（水和甲醇）加入1 mL混合溶劑（甲基叔丁基醚/甲醇/水（10∶3∶25，V/V/V））再次萃取，收集上層有機相。將2次收集的有機相用氮吹儀進行氮吹濃縮。用100 μL混合溶劑異丙醇進行復溶，之后用LC-MS/MS系統檢測分析，從每個已處理好的樣本中取等量上清液混勻作為QC樣本。色譜分析條件：色譜柱Thermo Accucore C30；柱溫40℃；流速為0.35 mL/min；進樣量5 μL；流動相A：（乙腈∶水=60∶40）+0.1%甲酸+10 mmol/L乙酸銨；流動相B：（異丙醇∶乙腈=90∶10）+0.1%甲酸+10 mmol/L乙酸銨。質譜分析條件：正負離子模式下：鞘氣，20個任意單位；掃描氣體，1任意單位；輔助氣量，5（負離子：7）；噴霧電壓，3 kV；毛細管溫度，350℃；加熱溫度，400℃；S-透鏡射頻水平，50；掃描范圍，114～1 700 m/z；自動增益控制目標，1e6；標準化碰撞能量，25、30（負離子，20、24、28）；注入時間，100 ms；隔離窗口，1 m/z；自動增益控制目標（MS2），1e5；動態排除，15 s。

1.3.6 脂肪酸組成測定

脂肪酸甲酯化：取20 μL油脂樣品放入具塞試管，加入1%的硫酸甲醇溶液1.5 mL，于80℃水浴鍋中水浴1 h，期間不時搖晃試管，水浴后依次加入飽和的NaCl溶液1 mL，去離子水1 mL，色譜純正己烷2 mL，靜置分層后從上層吸取750 μL放至進樣瓶進行GC-MS分析。檢測脂肪酸甲酯使用安捷倫7000D三重四極桿GC-MS儀進行分析。配有Agilent DB-23型色譜柱（內徑30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm）。所有測量在全掃描模式下（50～500 m/z）執行以下程序：初始溫度為130℃，保溫時間為1 min，然后以5℃/min上升至230℃，最終溫度為230℃，保溫5 min，總運行時間為26 min。采用自動進樣器分流（1∶20），進樣量為1 μL。

1.3.7 甘油酯組成測定

采用高效液相色譜（NP-HPLC，折射率檢測器）對甘油酯進行分析，HPLC儀器分析條件：Phenomenex Luna硅膠柱（內徑250 mm×4.6 mm×5 μm）；流動相為正己烷、2-丙醇和甲酸（21∶1∶0.003，V/V/V），流速1 mL/min；柱溫30℃；進樣體積為10 μL；每個樣品檢測時間為45 min。

1.4 數據分析

試驗所有數據均重復3次，數據運用利用EXCEL 2003、Origin 8.5來繪制圖形，SPSS軟件進行方差及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 核桃內種皮的蛋白質、脂肪分析

核桃內種皮與核桃仁蛋白質、脂肪含量對比（100 g干質量）見表1。

表1 核桃內種皮與核桃仁蛋白質、脂肪含量對比（100 g干質量）/g

和文獻[8]中報道的核桃仁營養成分比較，內種皮中蛋白質的含量相對較高，約為13.94%，比一般核桃仁中的蛋白質高出3.85 g/100 g；而脂肪含量相對較少，比一般核桃仁中的脂肪少約41.55 g/100 g。蛋白質含量是企業收購核桃原料時主要考量因素之一[9]。可以看出，核桃內種皮中富含較高的蛋白，具有一定利用價值。

2.2 核桃內種皮的氨基酸組成分析

通過HPLC發現核桃內種皮中富含16種氨基酸，包含7種必需氨基酸和9種非必需氨基酸。

核桃內種皮氨基酸組成及含量見表2。

由表2可以看出，核桃內種皮的總氨基酸（TAA）含量為77.96 mg/g，其中必需氨基酸（EAA）含量為25.85 mg/g，占比33.16%；非必需氨基酸（NEAA）含量為52.11 mg/g。必需氨基酸中亮氨酸的含量最高，達到6.13 mg/g，甲硫氨酸的含量最低，僅有0.84 mg/g；非必需氨基酸中谷氨酸（13.98 mg/g）和精氨酸（8.87 mg/g）的含量較高，胱氨酸的含量最低，為0.78 mg/g。必需氨基酸中的亮氨酸是復配氨基酸靜脈注射液的重要成分，對維持危重病人的營養需求有著積極的作用，同時亮氨酸在調節氨基酸和蛋白質代謝等方面也有重要作用；苯丙氨酸是氨基酸類抗癌藥物的中間體，也是生產腎上腺素、甲狀腺素和黑色素的原料。非必需氨基酸中的谷氨酸是鮮味氨基酸，在促進紅細胞生成、改善腦細胞營養及活躍思維等方面發揮重要作用[10]。核桃內種皮中氨基酸的含量及種類十分豐富，具有較大的開發應用潛力。

表2 核桃內種皮氨基酸組成及含量

2.3 核桃內種皮的脂質組成分析

通過液相二級質譜LC-MS/MS對核桃內種皮脂質組成進行分析研究，發現在正負離子模式下核桃內種皮共檢測出了10類甘油磷脂（PC，PE，PS，PEtOH，PMeOH，HBMP，PG，PI，PA，CL）、3類鞘脂（SM，Cer，GlcCer）、4類甘油酯（AcylGlcADG，GlcADG，DAG，TAG）、2類糖脂（MGDG，SQDG）、1類脂肪酰，共451種脂質代謝物。

甘油磷脂類有232種，其中包含磷脂酰膽堿（PC）96種、磷脂酰乙醇胺（PE）58種、磷脂酰絲氨酸（PS）11種、磷脂酰乙醇（PEtOH）1種、磷脂酰甲醇（PMeOH）1種、半雙（單酰基）甘油磷酸酯（HBMP）12種、磷脂酰甘油（PG）14種、磷酯酰肌醇（PI）18種、磷脂酸（PA）20種、心磷脂（CL）1種，測定結果顯示PC、PE的含量比較豐富。檢測出的96個PC分子種，其主要種類為17∶1/17∶1和18∶2/18∶2。

核桃內種皮甘油磷脂類PC分子種相對定量分析結果見表3。

由表3可知，檢測出的58種PE分子種的主要種類為16∶0/17∶1。PC、PE是細胞膜中最豐富的磷脂，其合成底物為三磷酸胞苷（CTP），可用于激活代謝物。機體組織中PC、PE含量的變化與代謝紊亂（如動脈粥樣硬化、胰島素抵抗和肥胖）有關[11]。

表3 核桃內種皮甘油磷脂類（PC）分子種相對定量分析結果

核桃內種皮甘油磷脂類PE分子種相對定量分析結果見表4。

表4 核桃內種皮甘油磷脂類（PE）分子種相對定量分析結果

鞘脂類共有77種，其中包含22種鞘磷脂

（SM），34種神經酰胺（Cer），21種葡萄糖神經酰胺（GlcCer）。鞘脂類（SM）的含量比較豐富，檢測出鞘磷脂的主要種類為15∶1/27∶1以及23∶1/13∶0。鞘磷脂是具有潛在的抑癌作用的一種脂類，與人體內的膽固醇、脂肪酸、毒枝菌素所引起的疾病有密切關系，已發現了鞘磷脂在一定程度上能夠預防動物的結腸癌與動脈硬化的形成[12]。甘油酯類共有132種，其中包含8種酰基葡萄糖醛酸基二酰甘油（Acyl-GlcADG），12種葡萄糖醛酸基二酰甘油（GlcADG），11種二酰甘油（DAG），101種三酰甘油（TAG）。糖脂類共有9種，其中包含7種單半乳糖二酰甘油酯（MGDG）和2種硫代異鼠李糖甘油二酯（SQDG）。脂肪酰類僅檢測出一種羥基脂肪酸脂肪酸酯（FAHFA），其種類為18∶1/18∶1。

核桃內種皮鞘脂類（SM）分子種相對定量分析結果見表5。

表5 核桃內種皮鞘脂類（SM）分子種相對定量分析結果

2.4 核桃內種皮的脂肪酸組成分析

通過GC-MS對核桃內種皮脂肪酸組成進行分析，結果見表4。核桃內種皮中飽和脂肪酸總含量為9.39%，其中棕櫚酸含量6.43%，硬脂酸含量為2.7%，豆蔻酸和十五烷酸的含量最低，僅為0.03%。單不飽和脂肪酸含量達23.28%，其中油酸含量高達23%，棕櫚油酸含量為0.08%。核桃內種皮中含有豐富的多不飽和脂肪酸，含量高達66.4%，其中亞油酸含量占51.9%，α-亞麻酸含量占14.5%。

不少研究發現，不飽和脂肪酸在降低膽固醇，預防、緩解心腦血管疾病、糖尿病和肥胖癥方面具有重要的功效，既可以作為輔助治療血栓的藥物，也可作為高級食用油，同時又可以開發成保健產品[13-14]。單不飽和脂肪酸對降膽固醇和降血糖都有明顯的作用，油酸不僅可以保護動脈免受損傷，而且對人體的循環系統也具有一定的保護功能[15-16]。多不飽和脂肪酸對癌細胞有毒性作用[17]。亞油酸能抑制膽固醇在小腸中的吸收，促進肝臟內膽固醇的降解和排除，改變體內膽固醇的分布，預防動脈硬化[18-20]。亞麻酸是機體的必需脂肪酸，在降低血脂血壓、抗血栓、改善心血管疾病、提高記憶力、保護神經組織、預防過敏性疾病、抑制腫瘤細胞轉移、延緩衰老等方面具有重要的生理學功能[19，21-22]。核桃內種皮富含油酸、必需脂肪酸亞油酸和α-亞麻酸，因此可以將其加工成高級食用油滿足消費者的飲食需求，也可以用來開發成新型保健產品、輔助治療相關病癥的藥物。

核桃內種皮脂肪酸組成及含量見表6。

表6 核桃內種皮脂肪酸組成及含量

2.5 核桃內種皮的甘油酯組成分析

通過HPLC檢測發現核桃內種皮中甘油二酯（DAG）含量為2.93%，其中1,3-甘油二酯含量為0.26%，1,2-甘油二酯含量為2.67%。甘油三酯（TAG）含量達到96.96%，游離脂肪酸（FFA）含量為0.11%。DAG是公認安全的食品成分，有研究表明，DAG具有減少內臟脂肪、抑制體重增加、降低血脂的作用。

核桃內種皮脂肪酸組成及含量見表7。

表7 核桃內種皮脂肪酸組成及含量

3 結論

對陜西香玲核桃內種皮的氨基酸組成及油脂中的脂質分子、脂肪酸和甘油酯組成進行綜合分析，結果表明核桃內種皮中蛋白質和脂肪含量分別為13.94 g/100 g和19.06 g/100 g；氨基酸種類豐富，包括7種必需氨基酸和9種非必需氨基酸，其中谷氨酸含量達到13.98 mg/g；內種皮油脂中鑒定出甘油磷脂類、鞘脂類、甘油酯類、糖脂類及脂肪酰類共451種脂質分子，其中PC、PE、SM及ADG相對含量較高；油脂中不飽和脂肪酸含量高達89.69%，其中油酸、亞油酸、α-亞麻酸含量最高；甘油三酯含量達到96.96%并含有少量的甘油二酯（2.93%）。核桃內種皮具有較高的營養價值和保健價值，可能為核桃內種皮的高值化利用提供理論基礎，減少資源浪費。