基于網絡藥理學探討瘤果黑種草子的抗炎機制*

趙凱悅 劉蜜敏 曾 利 姜海倫 李卓榮 徐 芳 劉 睿

(1.中國醫學科學院醫藥生物技術研究所，北京 100050)(2.新疆維吾爾自治區藥物研究所，烏魯木齊 830004)

瘤果黑種草子是毛茛科植物瘤果黑種草(NigellaglanduliferaFreyn et Sint.)的干燥成熟種子，是新疆維吾爾族習用藥物，具有補腎健腦、通經、通乳、利尿等功效[1]，其臨床制劑常被用于治療風濕病關節肌肉腫痛、腰膝冷痛[2]。現代藥理學研究發現，瘤果黑種草子所含活性成分豐富，在多種疾病動物模型上顯示出了抗炎、抗氧化、抑制腫瘤、保護肝臟等良好的藥理活性。瘤果黑種草子提取物能夠增強抗氧化酶活性，減少脂質過氧化物產生，改善四氯化碳誘導的小鼠急性肝損傷，抑制艾氏腹水瘤小鼠肉瘤生長[3-4]。在抗炎作用方面，瘤果黑種草子提取物能夠改善葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠潰瘍性結腸炎癥狀，減輕腸道炎性細胞浸潤[5]。其活性成分能夠降低濃氨水引咳小鼠的咳嗽次數，增強家兔氣管纖毛黏液流運動，抑制乙酰膽堿所致豚鼠平滑肌痙攣，降低慢阻塞肺病大鼠模型肺部組織炎性反應程度，改善乙醇誘導急性肝損傷小鼠相關指標水平，緩解佐劑誘導的大鼠關節炎損傷、化學物質誘導的小鼠耳廓腫脹[6-11]。以上動物實驗結果提示，瘤果黑種草子在治療類風濕性關節炎、慢性阻塞性肺病、支氣管痙攣、酒精性肝損傷等炎性反應相關的疾病方面有潛在應用。目前，研究者對瘤果黑種草子抗炎作用僅限于藥理活性的研究，缺乏對其抗炎作用機制的報道。

網絡藥理學可利用化合物靶標數據和疾病的人源性數據，針對中藥多組分多靶標的性質進行系統性分析，從多角度闡述中藥能夠調控與涉及的靶標網絡，進而分析藥物的潛在作用機制。本文基于網絡藥理學的分析方法，擬通過數據挖掘與分析整合，建立瘤果黑種草子化合物-靶標作用網絡，對潛在靶標的生物功能和信息調控通路進行富集，分析瘤果黑種草子抗炎相關的基因、分子和信號通路。

1 材料和方法

1.1 數據庫

使用Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)、UniProt數據庫(http://www.uniprot.org./)、PubChem數據庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、DrugBank數據庫(http://www.drug-bank.ca/)、OMIM數據庫(http://www.omim.org/)、GeneCard數據庫(http://www.genecards.org/)Cytoscape(3.7.0)軟件(http://cytoscapeweb.cytoscape.org/)、Venny2.1.0在線軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)、聯川生物云平臺(https://www.omicstudio.cn/tool/)、Metascape基因注釋分析工具(https://metascape.org/)和STRING數據庫(http://string-db.org/)等相關平臺和數據庫。

1.2 成分靶標數據集和炎性反應相關靶標數據集建立

通過文獻檢索瘤果黑種草子化學成分，利用PubChem和ChemDraw獲得成分結構sdf格式文件并借助Swiss Target Prediction預測化合物靶標。分別以“rheumatoid arthritis (RA)”“inflammation”“alcoholic hepatitis”“chronic obstructive pulmonary disease (COPD)”等為關鍵詞在OMIM、Genecards、DrugBank數據庫檢索炎性反應相關靶標并通過UniProt數據庫規范靶標的基因名。

利用在線韋恩圖繪制平臺Venny2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，繪制化合物和疾病靶標韋恩圖，獲得二者共同靶標并以此作為瘤果黑種草子抗炎作用的潛在靶標。

1.3 成分-共同靶標網絡構建

利用Cytoscape3.7.0構建成分-共同靶標網絡，以degree平均值為篩選條件，篩選排名靠前的成分。借助STRING數據庫，設置combing score值為0.9，限定物種為Homo sapiens，分析共同靶標蛋白互作網絡，以tsv格式保存文件。利用Cytoscape3.7.0中的Network Analysis工具分析互作網絡，篩選大于平均degree(度值)的靶標作為重要靶標。

1.4 GO生物功能富集分析與KEGG通路富集分析

為進一步闡明上述重要靶標蛋白的生物學功能和在信息調控中的作用，通過Metascape基因功能注釋分析工具，默認P≤0.01，物種限定為Homo sapiens，選擇Custom Analysis分析，進行GO生物功能和KEGG通路的富集分析。其中，GO生物功能分為細胞組成(cellular component，CC)、生物過程(biology process，BP)和分子功能(molecular function，MF)，使用聯川生物云平臺可視化富集結果。

2 結果

2.1 瘤果黑種草子活性分子的靶標預測、炎性反應相關靶標數據庫建立

經文獻挖掘整理，檢索到60個潛在活性分子。借助Swiss Target Prediction預測靶標，去除“probability”為0的靶標，最終收集到57個活性分子的潛在靶標信息，3個活性分子未收錄入該數據庫。將靶標數據去重處理得到1 066條信息。通過多數據庫、多關鍵詞聯合檢索的方法，合并去重處理數據，共收集到1 938個炎性反應相關疾病的靶標信息。

經在線韋恩圖軟件Venny2.1.0分析，活性分子和炎性反應相關靶標的共同靶標有318個，這些共同靶標可能是瘤果黑種草子發揮抗炎作用的潛在作用靶標。如圖1所示，藍色component代表活性分子靶標數量，黃色disease表示疾病靶標數量。

圖1 活性成分-疾病交集韋恩圖Fig.1 Venn diagram of the activecomponent-disease intersection

2.2 重要靶標的篩選

由String得到蛋白互作網絡圖，圖2中有318個節點，1 777條邊，平均節點度11.2，平均局部聚類系數為0.538。邊的粗細表示蛋白間作用的強弱。通過平均度值篩選出101個重要靶標。在網絡中，節點(Node)表示靶標，節點之間的連線(Edge)代表靶標間的相互作用。某一節點的degree值(度值)定義為網絡中該節點與其他節點連線的數目，度值大小反映了節點在網絡中貢獻度大小。通過度值篩選出排名前10的關鍵靶標，PIK3CA、STAT3、PIK3R1、APP、MAPK1、MAPK3、AKT1、SRC、CXCR4、TP53，提示這些靶標可能在瘤果黑種草子抗炎作用中起重要作用。

圖2 共同靶標蛋白互作網絡圖Fig.2 Interaction network of common target proteins

2.3 活性分子-共同靶標網絡構建分析

借助Cytoscape3.7.0構建活性分子-共同靶標的可視化網絡。網絡中含有375個點，2 440條邊。平均每個活性分子對應42.80(2 440/57)個靶標，每個靶標平均連接7.67個活性分子(2 440/318)，由此推斷，瘤果黑種草子的抗炎作用可能同時涉及一個活性分子對應多個靶標和一個靶標受多個活性分子干預的情況，體現了中藥多組分、多靶標的藥理作用特性。圖中黃色箭頭形狀代表共同靶標，粉色圓形代表活性分子。靶標圖形越大，表明其度值越大，提示其可能是網絡中的關鍵節點(圖3)。

圖3 活性分子-靶標互作網絡Fig.3 Active compound-target intersection network

2.4 GO生物功能富集注釋

采用Metascape數據庫對瘤果黑種草子的101個重要靶標進行基因本體(gene ontology，GO)富集分析2 354條，其中細胞組分(cellular component，CC)111條、分子功能(molecular function，MF)139條、生物過程(biological process，BP)2 104條。如表1，圖4所示，瘤果黑種草子抗炎作用的潛在靶標主要存在于胞膜和蛋白質復合物。如表2，圖5所示，分子功能富集結果提示，潛在靶標的分子功能主要有G蛋白偶聯的胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)、G蛋白偶聯神經遞質受體活性(G protein-coupled neurotransmitter receptor activity)、神經遞質受體活性(neurotransmitter receptor activity)、血清素受體活性(serotonin receptor activity)等。如表3，圖6所示，生物過程主要涉及機體對傷口的反應(response to wounding)、激酶活性的正調控(positive regulation of kinase activity)、轉移酶活性的正調控(positive regulation of transferase activity)、MAPK級聯反應的正調控(positive regulation of MAPK cascade)和細胞運動的正調控(positive regulation of locomotion)等。

表1 GO 細胞組分富集分析Table 1 GO cell component enrichment analysis

表3 GO生物過程富集分析Table 3 GO biological process enrichment analysis

2.5 KEGG通路富集注釋

對瘤果黑種草子抗炎重要靶標進行全基因組及代謝途徑(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，獲得165條通路。如表4,圖7所示，按照-LogP排序，排名靠前的有癌癥通路(pathways in cancer)、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、人類巨細胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、乙型肝炎(Hepatitis B)、癌癥中的多糖(proteoglycans in cancer)等通路。其中Th17細胞分化通路(Th17 cell differentiation)與自身免疫疾病密切相關，-LogP值為28.02。

圖4 GO 細胞組分富集分析Fig.4 GO cell component enrichment analysis

圖5 GO 分子功能富集分析Fig.5 GO molecular function enrichment analysis

3 討論

現代中藥技術對瘤果黑種草子的研究覆蓋了較多的研究領域，提示該藥具有抗氧化、抗病毒、抗感染、腫瘤抑制和免疫調節等多種藥理活性。瘤果黑種草子提取物可緩解LPS，木瓜蛋白酶所致大鼠COPD模型中的炎性細胞趨化、炎性因子水平升高，同時對急性酒精性肝損傷所致小鼠血液轉氨酶水平升高、肝小葉結構破壞、肝細胞壞死也有保護作用[7,9]。其總黃酮提取物具有抗炎，鎮咳作用，可以抑制大鼠棉球肉芽腫，延長噴霧致小鼠哮喘的反應潛伏期，抑制豚鼠離體肺支氣管灌流實驗和離體回腸實驗中工具藥物所致的平滑肌痙攣[12-13]。其總皂苷提取物能夠抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹及角叉菜膠所致的足趾腫脹[14]，減少冰醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性的增高，并對佐劑性關節炎的繼發性損害及膠原誘導型關節炎損傷有明顯的抑制作用[6]。上述研究顯示，瘤果黑種草子的有效成分具有良好的抗炎作用，本文結合中醫藥的“整體觀念”理論，分析瘤果黑種草子發揮多效抗炎作用的疾病靶標。上述研究顯示，瘤果黑種草子的有效成分具有良好的抗炎作用，本文結合中醫藥的“整體觀念”理論，分析瘤果黑種草子發揮多效抗炎作用的疾病靶標瘤果黑種草子用于治療風濕病所致的關節痛，緩解關節滑膜的慢性炎性反應。在這類疾病中，Th17被認為是驅動疾病發展的關鍵因素[15]。Th17細胞分泌促炎細胞因子IL-17和IL-21，協同放大其他細胞因子的致炎作用，激活滑膜成纖維細胞和巨噬細胞，促進分泌更多炎性物質，從而作用于多種胞內通路發揮促進破骨細胞分化、促進骨基質降解、抑制骨生成等作用，加劇關節炎性反應[16]。本研究的重要靶標篩選和基因通路富集結果顯示，與Th17細胞分化通路(Th17 cell differentiation)相關的基因有IL-6、IL-2、STAT3、STAT6、JAK1、JAK2、JAK3、JUN、MAPK1、MAPK等。Th17細胞的分化需要促炎因子和核轉錄調控因子的參與，在IL-6和TGF-β協同作用下，被持續激活的STAT3可解除由Foxp3介導的維甲酸相關孤兒受體(RORγt)的表達抑制作用[17]。STAT3直接作用于IL-21前體，促進其產生。IL-21通過STAT3依賴的途徑，誘導Th17細胞中RORγt表達增加和IL-17分泌[18]。由此可知，瘤果黑種草子極有可能通過作用于IL-6、SATA3等靶標減少Th17細胞產生IL-21和IL-17的炎性級聯反應，從而發揮改善風濕病中關節炎性反應及繼發性骨損傷的作用。

圖6 GO 生物過程富集分析Fig.6 GO biological process enrichment analysis

表4 KEGG通路富集分析Table 4 KEGG pathway enrichment analysis

圖7 KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis

COPD是持續性的氣道炎性反應所造成的進行性不可逆的氣道阻塞[19-20]。COPD患者中Th17相關細胞因子IL-17A、IL-22和IL-23的表達增加[21]。IL-17A不僅參與中性粒細胞募集過程，還誘導肺實質中巨噬細胞和樹突狀細胞產生促炎因子和趨化因子[22]。基于通路富集的結果，瘤果黑種草子可能通過影響Th17細胞的分化，進而影響IL-17A的分泌，在COPD的發展進程中起到抗炎治療作用。

在富集的重要靶標中，CXCR是趨化因子受體，誘導免疫細胞的定向遷移、活化與發育，有研究顯示在CXCR3配體誘導下COPD患者單核細胞和淋巴細胞的趨化性增加，這可能與COPD中CXCR3表達的增加相關[23]。COPD病理特征是嗜中性粒細胞浸潤，因此由趨化因子/受體作用的細胞遷移至炎性反應區域也是導致炎性反應的機制之一。本文預測，瘤果黑種草子與CXCR的靶標關聯性較強，提示瘤果黑種草子經由趨化因子受體途徑減少細胞炎性遷移的作用也可能是其發揮抗炎作用的機制之一。

除此之外，從生物過程富集分析和通路富集結果來看，瘤果黑種草子的發揮抗炎作用的核心通路還很多，主要體現在抵抗外來微生物的反應、抗病毒、調控激酶激活通路以及應對傷口反應等多個方面。

綜上所述，本文基于網絡藥理學的思路分析了瘤果黑種草子抗炎治療類風濕性關節炎、COPD等疾病的機制，構建了瘤果黑種草子活性分子-潛在靶標網絡，找到了IL-6、STAT3等關鍵基因及Th17、CXCR通路，為深入研究瘤果黑種草子發揮藥理作用的新通路和新調控基因提供了依據。因該藥物至今缺乏代謝產物的研究信息，故本文在有效物質基礎的分析方面有一定的局限性；此外，本文分析得到的重要靶標及關鍵信號通路有待進一步的生物學實驗驗證。