根際微生物防治土傳病害研究進展

魏 蕾

（北京市農林科學院，北京 100097）

根際，是微生物生存的主要區域之一，也是植物根系與土壤進行能量交換的重要場所，被認為是世界上最活躍的界面之一[1]。早在20世紀初，就有德國學者首次提出了根際一詞[2]，至2019年，德國哥廷根大學的學者Kuzyakov[3]將其精確定義為距根系0.5～4.0 mm寬的區域。根際土壤中的微生物種類眾多，有些會對植株生長造成不利影響，甚至引發植株發生土傳病害，包括病原真菌、細菌、線蟲等；而也有另一些根際微生物發揮著積極的作用，可促進土壤養分循環并抑制有害病原菌的繁殖，如芽孢桿菌、假單胞菌等細菌，木霉菌、酵母菌等真菌，鏈霉菌等放線菌。近年來，根際土壤微生物在土傳病害防治的研究中成為熱點，受到眾多學者的關注，其在土傳病害防控中的作用也得到相關研究的證實：日本學者Lee等[4]將對青枯病不同抗性的番茄品種的根際微生物進行互換，驗證了抗病植株根際存在能夠幫助植物抵抗番茄青枯病病原菌的有益微生物；伊斯蘭大學學者Islam等[5]證實黃瓜植株根際存在的銅綠假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）BA5，能夠有效抑制尖孢鐮刀菌黃瓜專化型［Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum（F O C）］病原菌菌絲的生長，抑制率可達58.33%；我國學者潘瀟涵等[6]發現哈茨木霉VT9-3r通過競爭機制和寄生機制可抑制立枯絲核菌病原，對馬鈴薯黑痣病防治效果顯著。在病原菌耐藥性逐漸增強、農業“雙減”及綠色農業發展理念的大背景下，研究探討病害防治新策略已成為農業研究的重中之重。因此，對根際微生物防治土傳病害研究進展進行綜述，可以為深入探索根際微生物防控土傳病害的研究提供參考。

1 根際有益微生物的種類

植物根際土壤中存在著大量的微生物，有些是有益菌，有些是有害菌，還有一部分是中性菌。而在這些微生物中，只有大約有2%～5%的微生物菌群對植物的生長和健康狀況有直接或間接的促進作用[7]，可以作為生防菌應用，促進植物生長。

1.1 根際真菌

土壤中的真菌種群生物量是最高的，其中的有益菌主要有木霉菌、酵母菌、淡紫擬青霉、從枝菌、毛殼菌、厚壁孢子輪枝菌、小盾殼霉。這些真菌在土傳病害的生物防治中發揮著不同的作用。

1.1.1 木霉菌

木霉菌在植物根際分布廣泛，主要包括哈茨木霉、棘孢木霉、長枝木霉、綠色木霉、康氏木霉、多孢木霉等[7]。由于木霉菌分離和培養容易，且對多種病原菌有拮抗作用；因此，利用木霉菌防治土傳病害的研究是最多的。1932年Weindling就對木霉菌對植物病原真菌的拮抗作用進行了研究，此后木霉菌的生防效果在很多試驗或生產中得到驗證，王天君[8]證實，擬康寧木霉78可通過空間競爭抑制馬鈴薯黑痣病菌的生長，使其菌絲發生斷裂、溢縮，最終導致病原菌解體死亡。Yedidia等[9]證實哈茨木霉菌株可穿透到黃瓜根部外皮層，產生一種類似誘導抗性，導致系統性獲得抗性。Sridharan等[10]研究發現長枝木霉菌可直接分泌揮發性有機物質VOCs，對菜豆殼球孢（Macrophomina phaseolina）病原真菌抑菌率達到58%。

1.1.2 酵母菌

酵母菌在人們的認知里，更多的是用于食品工業里發酵面包、葡萄酒等，近年來，研究者發現了其在生物防治方面的利用價值。El-Tarabily等[11]發現了酵母不僅可以作為植物生長劑，還可以作為抑制土傳真菌病害的生物菌劑。泰國曼谷卡塞薩爾大學Satianpakiranakorn等[12]學者研究發現酵母菌可用于幫助植物抵抗病原菌。我國學者尹曉燕等[13]成功從根際土壤中篩選出了可殺線蟲的假絲酵母YIN9菌株，菌株作用于全齒復活線蟲60 h后，線蟲死亡率達100%。施俊鳳等[14]也發現梅奇酵母XY201菌株能顯著抑制冬棗采后病原菌的孢子萌發和菌絲伸長。由于酵母菌擁有成熟的工業化生產技術，且培養周期短、殘留低，未來可作為生防藥劑開發的選擇。

1.1.3 淡紫擬青霉

淡紫擬青霉是一種應用較廣泛的生防藥劑，能有效防治土壤中的寄生線蟲，其可在30多種植物上應用，如小麥、玉米、棉花、高粱等大田作物以及蔬菜、花卉、藥材等。高學彪等[15]發現，淡紫擬青霉對南方根結線蟲卵的寄生率達60%～70%，還能產生促進植株生長的物質。張雅靜等[16]從根際土壤中篩選出對黃瓜根腐病和根結線蟲病均具有良好防效的淡紫擬青霉（2018-32）拮抗菌株，防效高于同類商品菌株。近年來國內外相繼利用液體、固體發酵技術工業化生產淡紫擬青霉商品制劑，用于根施、拌種或噴施，成本較低，且持效性強。有研究表明，在不重復添加菌劑的情況下，淡紫擬青霉對根結線蟲的防效在2～3年后仍可達30%以上，不污染農產品和環境。

1.1.4 從枝菌根真菌（AM菌）

從枝菌根真菌（AM菌）是土壤中生物量最大的一類真菌，對促進植物生長、降低植物病害有著顯著的影響。不過，直到1968年，美國學者Safir[17]才首次發現AM真菌可以減輕植物病害的現象，此后，科學家們才將研究重點從AM菌提高植物營養吸收并增加植物產量的方向轉向了其與土壤致病菌的互作關系的研究上來。AM菌抑制土壤致病菌的主要種類有球囊霉屬（Glomus）、類球囊霉屬（Paraglomus）和巨孢囊霉屬（Gigaspora），它們可以抑制病原菌對根系的侵染，減輕鐮刀菌屬、疫霉屬、絲囊霉菌屬等根部真菌引發的病害。如西球囊霉可降低根系滲透勢32%，顯著降低番茄南方根結線蟲數量，抑制線蟲早期感染[18]；地表球囊霉可抑制尖孢鐮刀菌引起的黃瓜枯萎病，降低幼苗病情指數26%[19]；株狀巨孢囊霉對尖孢鐮刀菌引起的蘆筍枯萎病效果顯著，可減少植株死亡率[20]。

1.1.5 其他

此外，毛殼菌、厚壁孢子輪枝菌、小盾殼霉等真菌也是生物防治的有益真菌。毛殼霉屬真菌超過400種，廣泛存在于土壤、空氣及植物和動物體內，其次級代謝物對某些病原菌有較好的抗性。有文獻報道，毛殼菌真菌可降低由鐮刀菌引起的番茄枯萎病[21]，將浸泡污染了毛殼霉菌的大米水噴灑在南瓜種子上，可以減少南瓜種子腐爛[22]。厚孢輪枝菌對南方根結線蟲卵囊的孵化有較強的抑制作用, 且隨孢子濃度的增加, 抑制作用逐漸加強[23]，林茂松等[24]從南方根結線蟲卵囊中分離出厚壁孢子輪枝菌，并證實其有寄生南方根結線蟲卵的能力，卵寄生率高達90.8%。我國第一個登記的生物殺線劑產品就是用于防治煙草根結線蟲的厚孢輪枝菌，由云南微態源生物科技有限公司在2007年登記成功[25]。小盾殼霉是1947年被發現并報道的，是一種菌核寄生菌，可通過寄生作用分解核盤菌的菌絲體和菌核，對防治溫室蔬菜土傳病害有一定的應用價值[21]。

1.2 根際細菌

根際細菌（PGPR）可以在植物根組織內、根組織上或根組織周圍生長，直接或間接促進植物生長。如假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、黃桿菌和大青金黃桿菌等。利用PGPR進行生物防治因環境友好的特點是很好的替代傳統防治技術的方法。目前應用較多的生防細菌主要有芽孢桿菌、假單胞桿菌。

芽孢桿菌兼具防病、促生作用。目前有報道的具生防作用的芽孢桿菌有解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、側孢芽孢桿菌、短小芽孢桿菌等，有些已經在防治青枯病、根腐病和枯萎病等病害上有較好的效果。有文獻報道解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對黃瓜枯萎病菌具有較強的拮抗能力，在有效防治黃瓜枯萎病的同時，對黃瓜的生長也有促進作用[26]。張婉菊等[27]用從番茄根系分離出的芽孢桿菌菌株驗證了其在黃瓜根系和根際土壤中具有良好的定殖能力，對黃瓜枯萎病的菌絲生長和孢子萌發均有顯著的抑制作用，防治效果達88.89%。馬榮等[28]利用高通量測序技術對北京青枯病發病地區番茄植株進行調研，發現健康植株根際存在青枯菌拮抗菌群，并獲得了對青枯病有顯著拮抗能力的細菌14株，包括已被用于青枯病防治的芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、寡養單胞菌屬、假單胞桿菌屬和鏈霉菌屬[29]。

假單胞菌通常被認為是通過分泌一種或幾種抗性物質來抑制病原菌生長的，主要有熒光假單胞菌、銅綠假單胞桿菌、弗雷德里克斯堡假單胞菌。鐘小燕等[30]分離到1株對香蕉枯萎病菌抑制作用很強的假單胞菌，其防治原理認為有兩種途徑，其一，通過抑制病原菌菌絲正常生長以至不能產孢進而導致菌絲消融；其二，通過吸附在孢子的周圍溶解細胞壁，造成原生質泄漏致使孢子死亡，從而實現其生物防治的作用。假單胞桿菌防治黃瓜枯萎病的研究結果較多，如銅綠假單胞桿菌BA5可有效防治黃瓜枯萎病，對枯萎病菌菌絲抑制率達58.33%[5]；熒光假單胞桿菌也可降低黃瓜枯萎病發病率，對枯萎病菌菌絲抑制率達87.04%[31]；弗雷德里克斯堡假單胞菌33-1不僅對黃瓜有促生作用，而且對黃瓜枯萎病防效可達86.95%[32]。

1.3 根際放線菌

放線菌的種類較多，可通過產生植物激素、次級代謝產物，誘導植物系統抗性，調整根際微生物群落結構等途徑抵御植物病害。從1872年被發現至今，已經報道了69個屬1 687個種，在植物生物防治中的主要根際放線菌是鏈霉菌屬，許多研究也是針對鏈霉菌的研究。劉燕娟等[33]從天山土樣中分離到放線菌株HND39，通過16S rDNA序列分析，鑒定該菌株為微紅鏈霉菌，其代謝產物對油菜菌核病菌、辣椒炭疽病菌等15種重要植物病菌具有明顯的抑制效果。胡琴琴[34]研究表明，施用黃微綠鏈霉菌菌劑顯著改變了西瓜幼苗根際土壤微生物群落結構，能顯著降低西瓜枯萎病的發生率，促進西瓜幼苗的生長，對嫁接西瓜連作土壤和自根西瓜連作土壤上的西瓜幼苗株高、根系活力、SPAD值、冠幅面積及土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶活性均有不同程度的提高。李新等[35]研究表明拮抗種群數量最多的是放線菌，因此在研究放線菌拮抗效用的基礎上應該更加明確其有效成分，從而開發高效的菌劑。

2 根際微生物防治土傳病害機制研究

19世紀末期，國外土壤微生物學就已經出現根際微生物區系的研究，而我國直到20世紀60年代才開始關注根際微生物。根際土壤中有著復雜的微生物群落，一般認為，有益微生物可以通過競爭、拮抗、重寄生3種方式影響土傳病原菌的入侵[36]，在競爭及拮抗的過程中，又可誘導植物產生系統性抗性。

2.1 競爭機制

競爭主要體現在對營養的競爭上，也體現在對生存空間的競爭上。根際土壤為微生物群提供了一個由物理、化學、生物因素共同驅動的生存環境，為了占據有限的根際生態位，獲得有限的根際營養，根際微生物之間必然會產生生存的競爭。鐵競爭與碳競爭是生防微生物對病原菌的重要防治機制，根際微生物對鐵和碳的競爭可以驅動其對土傳病原菌的控制[37]。如植物根際的生防放線菌[38]、假單胞菌[39]可以產生嗜鐵素，嗜鐵素是輔助微生物獲取土壤中三價鐵離子的重要物質，有了嗜鐵素的加持，生防放線菌和假單胞細菌可以更好地吸收土壤中的鐵離子，在與病原菌競爭土壤中的稀缺鐵元素中勝出，導致病原菌因缺鐵而無法正常生長繁殖，實現控制植物病害的目的。Borrero等[40]研究發現，根際微生物通過競爭碳源抑制病原菌的生長，當碳源消耗率高時，番茄青枯病發病率明顯降低。顯而易見的，有益微生物在營養爭奪中取得勝利后，必然成為根際優勢種群，占據根際有限的生態位，極大地減少病原菌的生存空間。此外，黎起秦等[41]研究發現，枯草芽孢桿菌還可以在番茄維管束中定殖，有效地防治番茄青枯病。

2.2 拮抗機制

根際微生物對營養物質的競爭，通常會觸發拮抗物質的產生，限制病原菌的毒力，從而進一步擊退病原體。根際微生物產生的拮抗物質主要是抗性次級代謝產物、可溶性酶等[36]。

抗性菌產生的次級代謝產物可通過破壞細胞膜通透性、干擾蛋白質合成以及誘導植物產生抗性等機制對致病菌產生抑制[42]，主要有生物堿類、脂肽類、大環內酯類和萜類等物質，不同的化合物成分對目標致病菌的作用效果不同，如解淀粉芽孢桿菌可分泌酮類化合物，對歐文氏菌有很好的防治效果[43]；假單胞菌是最先被證明可以產生吩嗪類化合物的菌株[44]，對炭疽病有較好防效。喬欣蕾等[45]從枯草芽胞桿菌菌株Z-5中分離出脂肽抗生素類的C14伊枯草菌素A、C15伊枯草菌素A和C14-C18芬芥素A，可以抑制尖孢鐮刀菌的活性組分。武志華等[46]從包頭地區土壤中分離出橙色粘球菌（Myxococcus fulvus），其拮抗次生代謝物主要是N-（3-氨基-2-羥丙基）-N-甲基硫酸二酰胺與甲基（2R）-2-疊氮基-3-羥基-2-甲基丙酸酯，可明顯抑制馬鈴薯晚疫病的發生。Cha等[47]發現，鏈霉菌可產生一種硫肽康普霉素，通過抑制鐮刀菌細胞壁生物合成來抑制草莓枯萎病害。Lee等[48]從銅綠假單胞菌中純化得到吩嗪-1-羧酸，對辣椒疫病和黃瓜炭疽病有非常顯著的保護作用。吩嗪-1-羧酸對病原菌的作用機制目前已被探明，一個是通過產生有毒的超氧離子和過氧化氫，氧化谷胱甘肽和轉鐵蛋白，進而產生高細胞毒性的羥自由基[49]；另一個是其能夠被還原型輔酶I（NADH）還原成為電子傳遞的中間體，擾亂病原菌細胞內正常的氧化還原穩態，進而影響細胞能量的產生，從而抑制微生物的生長[50]。不過目前仍有許多次級代謝產物的作用機制并未研究清楚，對于根際微生物產生的抗生素的探索對生物農藥的研發意義重大。

此外，根際微生物還可產生可溶性胞外酶，通過不同形式發揮作用。如纖維素酶、殼多糖酶、蛋白酶、幾丁質酶等。國內外關于細胞壁降解酶抑制作用的研究較多，如芽孢桿菌分泌的纖維素降解酶、半纖維素降解酶等多種酶類可對紋枯病菌、枯萎病菌和疫病等產生較強的溶菌作用[51]。喬欣蕾等[45]研究發現，枯草芽胞桿菌能夠產生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等可以分解真菌細胞壁的酶類以及產生嗜鐵素、脂肽抗生素等抑菌物質，對尖孢鐮刀菌具有顯著的拮抗活性。郝建安等[52]從解淀粉芽孢桿菌中分離出粗蛋白，對茄鐮刀菌（Fusarium solani）有明顯抑制作用。

2.3 誘導植物系統性抗性

根際微生物在產生活性代謝物質的同時可激發誘導植物系統性抗性，稱為誘導系統抗性（Induced systemic resistance，ISR），ISR最早是1997年Bigirimana等用哈茨木霉T39菌株接種菜豆根部，誘導了菜豆對灰霉病和炭疽病的系統抗病性[53]。隨后大量研究證明，假單胞菌、芽孢桿菌和AM真菌等均可誘導植物系統抗性，激活植物多種防御機制共同抵御病原菌的危害[54]。如熒光假單胞菌PEF-5#18（野生型）能有效降低由尖孢鐮刀菌Forl引起的番茄枯萎病的病情指數，促進植株健康生長，其對番茄ISR誘導抗性主要依賴于茉莉酸和乙烯路徑來調控[55]。 Wees等[56]發現熒光假單胞菌能夠在擬南芥根際定殖，誘導植株系統性抗性，上調宿主中與植物病原菌防御相關的基因表達水平。目前針對ISR的機理研究還不深入，還處于初級階段，認為系統抗性誘導抗病過程主要涉及免疫信號因子、誘導抗性過程中的信號轉導以及相關調控基因等[57]。

2.4 重寄生機制

根際微生物還可以直接作用于病原菌，這也是其防治土傳病害的重要機制。生防微生物利用病原菌為自身提供營養物質，抑制其正常生理活動，阻礙其生長定殖，隨之病害的發生率也相應降低。郭成瑾等[58]研究表明哈茨木霉M-33可通過空間競爭和重寄生機制對立枯絲核菌產生作用，哈茨木霉M-33的菌絲可侵入立枯絲核菌菌絲內部，造成立枯絲核菌菌絲萎縮、塌陷、斷裂、崩解等。尤佳琪等[59]研究證實擬康寧木霉T-51菌株對核盤菌屬和絲核菌屬病原真菌重寄生能力較強，對鐮刀菌、暹羅刺盤孢菌等也有一定重寄生能力。盾殼霉對核盤菌屬真菌專性寄生，用盾殼霉可以寄生土壤中的菌核，抑制子囊盤萌發，減少初侵染源，對作物菌核病有很好的防病效果[60-62]。因而在歐美早已有盾殼霉生防菌劑，我國也于2018年獲批盾殼霉生防菌劑登記，用于防治油菜菌核病[63]。

3 未來研究展望

3.1 重視根際微生物組的研究

根際是復雜的微生態環境系統，根際微生物種群、根系分泌物、根際環境因子等協同作用，對土傳病原體產生或促進或抑制的作用；因此，被稱為農作物第二基因組的根際微生物組（rhizosphere microbiome）是未來研究的熱點。根際微生物組包括環境中的所有生物和非生物因素，即特定環境中全部微生物群、微生物群的基因和基因組、微生物群的產物、宿主環境[1]。深入研究根際微生物組裝配過程的驅動因素及與寄主植物間的互作，探究土壤根際微生物與農作物表型、基因型之間的關聯，可以更好地解決土壤健康生產的問題。

3.2 探索新的研究方法

隨著高通量測序技術、宏基因組學、代謝組學、宏轉錄組學及宏蛋白組學的發展，為根際微生物的研究開辟了新思路，使對于根際微生物群落的研究越來越便捷，但更多的只是分析菌群的結構和功能，不能獲得個體微生物菌株，要想獲得純培養的菌株，還只能采用傳統的平板涂布法，但此法能夠培養出的根際微生物仍較有限，難以進行單株水平上的研究；因此，探索更有效的分離培養技術是未來的重要方向，如Nicho1s等[64]設計的分離芯片，成功培養出許多新的微生物。VanInsberghe等[65]使用8種不同的微生物培養基，分離培養出了森林土壤樣本測序所得序列約22%的微生物。近期有學者提出，可將基于深度測序的微生物多樣性數據與目標菌株的分離培養有機銜接起來獲得菌株，基于這一思路，Chai等[66]根據梭菌綱梭狀芽孢桿菌特異性16S rRNA基因序列，利用KOMODO平臺（KOMODO平臺包括的培養基配方超過18 000多種，網址為http：//Komodo.Modelseed.org/）預測的培養基，成功從發酵谷物中分離出Clostridium菌株。

3.3 科學應用根際微生物

對于根際微生物的研究主要是為了應用，有很多生防菌制劑也已經獲得了農藥登記，但由于受土壤因子、環境因子、菌株適應性等多種因素的制約，其防效并不能同實驗室條件下一樣表現良好，實際應用不穩定，限制了應用。未來可通過添加外源物或基因修飾等方法，提高生防菌在環境中的競爭力及對寄主植物的定殖能力，其次，開發有益根際微生物組合菌劑可以克服單一菌株表現不佳的缺陷，提高防病效果。