大鼠CaM(nNOS)-pGEX-4T-1原核表達載體構建及蛋白表達＊

孟利 杜彩萍

（徐州醫科大學，江蘇省腦病生物信息重點實驗室，生物化學與分子生物學研究中心，江蘇徐州 221004）

0. 引言

神經型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）是一氧化氮合酶家族的成員之一，是一種廣泛分布于神經細胞和非神經細胞中的催化酶，是一類結構類似于細胞色素P450還原酶的同工酶[1]。神經型一氧化氮合酶在NO合成過程中起著限速酶的作用。nNOS可以通過催化NO信號分子的產生進而在許多生理、病理過程中發揮重要作用，nNOS蛋白缺乏或者活性異常會引起一系列疾病[2-8]。我們前期的研究發現，蛋白質翻譯后修飾SUMO化可以調節nNOS活性，并參與調節突觸傳遞[9]。除了SUMO化，磷酸化也是調節nNOS活性的主要方式。nNOS的主要結構域包括位于氨基端的PDZ結構域，中間的ARG/HEAM/BH4結構域，鈣調素結合（CaM）結構域，FMN結構域以及位于羧基端的FAD-NAPDH結構域[10]。

目前的研究發現，nNOS的CaM結構域可以通過與CaM結合來調節nNOS的活性，影響NO的生成，進而影響胞內一系列生化反應。nNOS的CaM結合結構域對其自身功能的發揮起著重要的作用[11-14]。為了進一步揭示nNOS的CaM結合結構域的作用，本研究構建CaM（nNOS）-pGEX-4T-1原核表達載體，并通過改變誘導劑IPTG（Isopropyl β-D-Thiogalactoside）的濃度及誘導的時間和溫度，來獲得高效表達的CaM（nNOS）蛋白，為進一步探究CaM結合結構域對nNOS的功能的影響提供了基礎。

1.材料與方法

1.1 材料

（1）試劑PCR Master Mix、Wizard Plus SV Minipreps DNA Puri fi cation System、GeneClean、LB瓊脂均購自上海生工生物工程有限公司；限制性內切酶BamH Ⅰ、EcoRⅠ、T4 DNA ligase購自New England Biolabs公司；LB培養基購自Invitrogen公司；DL1000、DL2000、DL5000 DNA marker均購自Takara公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；Plus Prestained Protein Ladder（26616，26619）購自Thermo公司；抗GST蛋白的抗體購自Millipore公司。測序委托上海生工生物工程有限公司完成。

（2）細胞與質粒感受態細胞DH5ɑ、BL21購于上海生工生物工程有限公司；nNOS-pME18S質粒由本室保存。

1.2 方法

（1）引物設計與合成，引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

（2）CaM-nNOS重組表達載體的構建 以nNOS（全長）-pME18S重組子為模板，PCR擴增CaM-nNOS cDNAs（2040bp～2400bp），用1.5%瓊脂糖凝膠純化目的基因。在連接酶的作用下與pGEM-T vector相連，連接產物轉入感受態細胞DH5ɑ中，于大腸桿菌細胞中擴增。提取質粒經EcoR I、BamH I酶切，同時酶切pGEX-4T-1，回收純化，將目的基因亞克隆入原核表達載體pGEX-4T-1。挑取陽性克隆，提取質粒經酶切鑒定后選取陽性重組子委托上海生工生物工程有限公司進行測序分析。

（3）蛋白的誘導表達將CaM-nNOS重組表達載體轉化入BL21感受態細胞中，在LB培養基中擴增質粒至菌液在600nm的OD值約0.6～0.8時，加入不同濃度誘導劑IPTG，于16℃條件下誘導蛋白表達。

（4）免疫印跡檢測蛋白的表達取1ml菌液離心獲取菌體，加入100μl上樣緩沖液1x laemmli Buffer，沸水浴5min變性處理。取20μl樣品經10%SDS-PAGE分離后，電轉到硝酸纖維膜（NC）膜上，3% BSA室溫封閉2h～3h，用抗GST抗體（1:5000）孵育過夜，washing buffer（10 mmol/L Tris, 100 mmol/L NaCl, 0.1% Tween-20）洗膜5次，每次3min。加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔二抗工作液，室溫孵育50min后，washing buffer洗膜（5min×5次），用超靈敏化學發光液顯色，BioChem 化學發光儀曝光獲取目的條帶。

2. 結果

2.1 成功構建CaM-nNOS- PGEX-4T-1原核表達載體

nNOS的蛋白質結構如圖1A所示。為了構建CaM-nNOSPGEX-4T-1原核表達載體，以全長nNOS-pME18S重組體為模板，加入上、下游引物，PCR擴增出目的基因，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定發現，位于約400bp處有目的條帶（見圖1B），將經純化后的PCR產物與pGEM-T vector在酶的作用下相連，連接產物轉入感受態細胞DH5ɑ中，于大腸桿菌細胞中擴增，酶切后經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定發現，載體和目的條帶分子量與預期一致（見圖1C）。

圖1 CaM-nNOS-pGEX-4T-1原核表達載體構建與鑒定。（A）nNOS蛋白的主要結構域示意圖。（B）PCR產物的鑒定。（C）CaM-nNOS-pGEM-T vector經 EcoR I、BamH I酶切鑒定。（D）1、2, CaM-nNOS-pGEX-4T-1 未經酶切 ； 3、4,CaM-nNOS-pGEX-4T-1經EcoRI、BamHI酶切鑒定。M, DNA marker。

取測序正確的質粒及pGEX-4T-1原核表達載體分別采用EcoR I、BamH I酶切，膠回收純化后在連接酶的作用下連接，連接產物轉入感受態細胞DH5ɑ中，于大腸桿菌細胞中擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定發現，載體和目的條帶都清晰（見圖1D），以上結果表明，CaM-nNOS-pGEX-4T-1原核表達載體成功構建。

2.2 CaM-nNOS蛋白的誘導表達

采用IPTG誘導并檢測CaM-nNOS蛋白的表達。將CaM-nNOS-pGEX-4T-1原核表達載體轉入BL21感受態細胞中，再加入LB培養基擴增至菌液在600nm的OD值為0.6～0.8時，加入不同濃度的IPTG(0.25mmol/L，0.5mmol/L)于16℃誘導20h，采用SDS-PAGE來分離蛋白后，采用抗GST抗體免疫印跡，結果如圖2所示，與GST空載體組及未誘導組相比，除了GST條帶，誘導劑組出現目的條帶；且0.5mmol/L誘導劑組較0.25mmol/L組表達水平高，因此，蛋白誘導表達成功。

圖2 CaM-nNOS蛋白表達的鑒定。免疫印跡鑒定在誘導溫度為16℃，IPTG的濃度在0.25 mmol/L，0.5 mmol/L，誘導時間為20h，CaM-nNOS蛋白的表達。

3.討論

前期研究表明，CaM是nNOS的變構激活蛋白。在外源刺激引起胞內Ca2+濃度升高時，可以促進鈣調素蛋白（CaM）與nNOS的鈣調素蛋白結合結構域相結合，從而引起nNOS的活化而發揮催化作用[11]。由此可見，CaM對 nNOS蛋白質活性及功能發揮極其重要。

目前，常用的體外蛋白表達載體主要有真核表達載體及原核表達載體。真核細胞常見表達載體為：pCDNA3.1載體、pAdTrack載體、pEGFP增強型綠色熒光蛋白表達載體、pSV2表達載體、CMV4表達載體等。而原核表達載體常用的主要包括pET系列、pGEX系列、pMAL系列等。根據實驗需求及后續實驗的開展來選擇目標載體。

為了進一步探究nNOS鈣調素蛋白結合結構域的作用，本實驗構建了CaM-nNOS-pGEX-4T-1原核表達載體，與真核表達載體相比，主要優點體現在：原核細胞中誘導蛋白表達成本低、蛋白量大、所需時間短、便于操作。pGEX-4T-1載體帶有GST標簽，小分子蛋白可以與GST融合表達，便于后續蛋白表達的檢測。蛋白可以采用GST柱子純化，有利于后續蛋白互作等試驗的開展。但是缺點在于，真核啟動子在原核細胞中作用效率不高，如圖2所示，雖然有表達，但是豐度不夠。在蛋白分子量大的情況下，與GST融合表達容易引起蛋白表達不完整，表達出GST融合蛋白片段較多，真正的目的蛋白反而較少。本次實驗構建的CaM-nNOS-pGEX-4T-1原核表達載體的表達效率不高，分析可能與這兩個因素相關。

4. 結論

通過分子克隆技術構建了CaM-nNOS-PGEX-4T-1原核表達載體，并探索了其誘導表達條件，這為進一步開展nNOS相關研究提供了一定基礎。