檸檬烏梅提取液預(yù)防腎草酸鈣結(jié)石作用機(jī)制的研究

林馥嘉 歐財(cái)文 柯培鋒 陳曲波 徐建華

廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510120

隨著現(xiàn)代社會(huì)人們的生活方式改變及日常工作中心理壓力的上升，腎結(jié)石患者的發(fā)病率已經(jīng)呈現(xiàn)了逐年攀升的態(tài)勢(shì)，我國(guó)腎結(jié)石患者發(fā)病率為1%～5%［1-2］。腎結(jié)石主要是泌尿系統(tǒng)的一種非常常見(jiàn)的多發(fā)性疾病，是擺在我們面前的一大難題。因此，在積極治療泌尿系結(jié)石患者的同時(shí)，重視和加強(qiáng)對(duì)結(jié)石病變的預(yù)防和復(fù)發(fā)措施也是必不可少的。

本研究擬通過(guò)建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)型，探討檸檬烏梅提取液對(duì)預(yù)防腎草酸鈣結(jié)石的協(xié)同作用機(jī)制，為進(jìn)一步臨床預(yù)防腎結(jié)石以及開(kāi)發(fā)新藥提供理論基礎(chǔ)依據(jù)。

材料與方法

1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量200～250 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物研究中心進(jìn)行提供。

2、儀器與試劑

日立7180全自動(dòng)分析儀和配套的化學(xué)試劑，Olympus光學(xué)顯微鏡，白洋牌常規(guī)離心機(jī)，良平電子天平，超速離心機(jī)（Eppendorf，離心半徑為11 cm），石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡），pH計(jì)（梅特勒-托利），乙二醇和氯化銨（天津市天力化學(xué)試劑有限公司），兔抗骨橋蛋白（OPN）的多克隆動(dòng)物抗體和動(dòng)物免疫組化SP試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

3、檸檬烏梅提取液提取

首先取新鮮的檸檬100 g，洗凈，置于2 000 ml大小的燒瓶中，加二次性溫開(kāi)水800 ml，煮沸60 min，過(guò)濾。濾渣首先加二次性清水600 ml，煮沸40 min，過(guò)濾。合并兩次檸檬過(guò)濾液，濃縮后即可形成一種具有可溶性生藥濃度含量范圍大約為0.05 g/ml的中性檸檬原液，用高速離心機(jī)對(duì)原液進(jìn)行離心（16 000 r/min，離心半徑為11 cm）10 min，取出檸檬上清液，即檸檬提取液。取新鮮烏梅100 g，洗凈，放入2 000 ml大小的燒杯中，加二次性溫開(kāi)水800 ml，煮沸60 min，過(guò)濾。濾渣再加二次性清水600 ml，煮沸40 min，過(guò)濾。合并兩次上清過(guò)濾液，濃縮后即可形成一種生藥濃度含量范圍大約為0.05 g/ml的烏梅上清原液，用高速離心機(jī)對(duì)原液進(jìn)行離心（16 000 r/min，離心半徑為11 cm）10 min，取出烏梅上清液，即烏梅提取液。兩種提取液混合搖勻得檸檬烏梅提取液。

4、建立腎草酸鈣結(jié)石模型和給藥

參照曹正國(guó)等［3］研究者的建模方法，選擇分組使用SPF級(jí)雄性Wistar大鼠50只，在適應(yīng)環(huán)境變化條件下連續(xù)飼養(yǎng)3 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組10只，設(shè)立A組（對(duì)照組）、B組（成石組）、C組（檸檬提取液組）、D組（烏梅提取液組）、E組（檸檬烏梅提取液組）。參照《中藥藥理研究方法學(xué)》計(jì)算劑量，A組大鼠以自來(lái)水作為日常飲用水，每天用純凈水灌胃；B組以含1%乙二醇+2%氯化銨的自來(lái)水作為日常飲用水，每天用純凈水灌胃；C、D、E組在B組的基礎(chǔ)上每天分別以檸檬提取液、烏梅提取液、檸檬烏梅提取液灌胃；連續(xù)喂養(yǎng)4周。

5、檢測(cè)指標(biāo)和檢測(cè)方法

第30天收集24 h尿液，檢測(cè)尿量、尿鈣（尿Ca2+）、尿尿酸（尿UA）、尿肌酐（尿Cr）、尿草酸（尿OX）檢測(cè)；第30天，20%濃度的烏拉坦（0.7 ml/kg）進(jìn)行腹腔麻醉后，下腔靜脈采血3～5 ml，離心后取上清液，全自動(dòng)生化分析儀檢進(jìn)行測(cè)大鼠血中肌酐（血Cr）、尿素氮（尿BUN）、鈣（血Ca2+）、磷（血P）的含量；第30天，切取腎臟做冰凍切片，偏光顯微鏡下進(jìn)行觀察，記錄腎臟組織結(jié)晶的情況及腎小管擴(kuò)張的情況；第30天，留取腎臟，采用10%中性福爾馬林固定腎臟組織制成3μm的石蠟切片，脫出石蠟后入水，使用免疫組化和蘇木素復(fù)染，制片，顯微鏡下即可觀察結(jié)果，病理軟件分析OPN含量結(jié)果。

6、統(tǒng)計(jì)分析方法

本文采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有組間參數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中所有組間參數(shù)等計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，用（±s）表示，組間差異用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)晶評(píng)分及OPN強(qiáng)度評(píng)分用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1、各組大鼠24 h尿液的相關(guān)結(jié)果

各組大鼠24 h尿液的相關(guān)結(jié)果如表1所示：B組的24 h尿量明顯低于其他各組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），C組和D組的24 h尿量明顯低于A組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），E組的24 h尿量也明顯低于A組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），C組、D組、E組3組的24 h尿量相比，結(jié)果數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。E組尿液pH的測(cè)定結(jié)果比B組高，結(jié)果數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余各組相比差異變化不大，結(jié)果數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。B組、C組和D組的24 h尿Ca2+結(jié)果明顯高于A組和E組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），A組、E組的24 h尿Ca2+結(jié)果相比差異不大，結(jié)果數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。B組、C組、D組、E組的24 h尿OX結(jié)果明顯高于A組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），與B組相比，C組和D組的24 h尿OX含量減少，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），E組24 h尿OX的含量明顯降低，結(jié)果數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），C組和D組的24 h尿OX高于E組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。B組、C組、D組的24 h尿UA結(jié)果明顯高于A組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），與A組相比，E組的24 h尿UA增高，結(jié)果數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），C組、D組和E組的24 h尿UA結(jié)果明顯低于B組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。B組的24 h尿Cr明顯低于A組、C組和E組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），低于D組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），C組和D組的24 h尿Cr低于A組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），C組和D組的24 h尿Cr低于E組，結(jié)果數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），A組和E組的24 h尿Cr變化不大，結(jié)果數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠24 h尿液尿量、尿pH值、尿Ca2+、尿OX、尿UA、尿Cr比較（±s）

表1 各組大鼠24 h尿液尿量、尿pH值、尿Ca2+、尿OX、尿UA、尿Cr比較（±s）

注：A組大鼠以自來(lái)水作為日常飲用水，每天用純凈水灌胃；B組以含1%乙二醇+2%氯化銨的自來(lái)水作為日常飲用水，每天用純凈水灌胃；C、D、E組在B組的基礎(chǔ)上每天分別以檸檬提取液、烏梅提取液、檸檬烏梅提取液灌胃；OX為草酸，UA為尿酸，Cr為肌酐；與A組相比，a P＜0.01，b P＜0.05；與B組相比，c P＜0.01，d P＜0.05；與E組相比，e P＜0.01，f P＜0.05

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2、各組血液的相關(guān)生化指標(biāo)結(jié)果

各組的大鼠血液相關(guān)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果如表2所示：B組的相關(guān)生化大鼠血液BUN明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與A組相比，C組、D組和E組的相關(guān)生化大鼠血BUN明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），C組、D組、E組3組的相關(guān)生化大鼠血BUN相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。B組的大鼠血液Cr明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與A組相比，C組、D組和E組的血Cr明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），C組和E組的大鼠血Cr相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），D組和E組的大鼠血Cr相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組大鼠的血Ca2+和血P的檢測(cè)結(jié)果比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表2 各組大鼠血BUN、血Cr、血Ca2+、血P比較（±s）

表2 各組大鼠血BUN、血Cr、血Ca2+、血P比較（±s）

注：A組大鼠以自來(lái)水作為日常飲用水，每天用純凈水灌胃；B組以含1%乙二醇+2%氯化銨的自來(lái)水作為日常飲用水，每天用純凈水灌胃；C、D、E組在B組的基礎(chǔ)上每天分別以檸檬提取液、烏梅提取液、檸檬烏梅提取液灌胃；BUN為尿素氮，Cr為肌酐，P為磷；與A組相比，a P＜0.01，b P＜0.05；與B組相比，c P＜0.01；與E組相比，d P＜0.05

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3、各組大鼠腎臟病理切片中草酸鈣晶體結(jié)果

草酸鈣結(jié)晶在HE及Van-Kossa，s染色病理切片上呈現(xiàn)黑褐色。A組的大鼠沒(méi)有看到任何草酸鈣結(jié)晶沉積和腎小管不見(jiàn)任何擴(kuò)張（圖1A）；B組鏡下多數(shù)腎小管腔內(nèi)均存在連續(xù)片狀結(jié)晶，部分腎小管存在連續(xù)的團(tuán)狀結(jié)晶，可以清楚地看到見(jiàn)腎小管管腔明顯的擴(kuò)張（圖1B）；C組、D組和E組鏡下即可觀察，小部分腎小管管腔擴(kuò)張，腎小管管腔中偶爾可見(jiàn)一定量的點(diǎn)狀散布草酸鈣結(jié)晶，偶爾也可見(jiàn)成為片狀結(jié)晶，草酸鈣結(jié)晶沉積和腎小管管腔擴(kuò)張等情況均顯著較B組改善（圖1C）。結(jié)晶分級(jí)見(jiàn)表3，根據(jù)表3數(shù)據(jù)，采用多個(gè)單獨(dú)樣品進(jìn)行比較的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，可以確定各組腎小管的結(jié)晶差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中A組無(wú)結(jié)晶形成，B組結(jié)晶最明顯。相對(duì)B組，C組、D組和E組各組含有少量的草酸鈣結(jié)晶。C組、D組和E組組間比較，采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，E組與C組和D組組間腎小管結(jié)晶差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），C組與D組組間腎小管結(jié)晶差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠腎臟病理切片中草酸鈣晶體結(jié)果。A：A組，HE染色，×200；B：B組，HE及Van-Kossa，s染色，×400；C：C組、D組、E組，HE及Van-Kossa，s染色，×400

表3 各組大鼠腎小管草酸鈣結(jié)晶分級(jí)（只）

4、各組大鼠腎臟OPN結(jié)果

OPN在各組大鼠的腎臟組織中均有表達(dá)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在腎近曲小管和遠(yuǎn)曲小管、亨利氏袢、集合導(dǎo)管（主要髓袢升支）上表達(dá)最為突出，在皮質(zhì)腎小球中反而未發(fā)現(xiàn)有OPN的表達(dá)。A組大鼠只能檢測(cè)到OPN微量表達(dá)（圖2A），但是B組大鼠腎組織中OPN表達(dá)則明顯增強(qiáng)（圖2B），C組、D組和E組大鼠腎組織中OPN表達(dá)強(qiáng)度高于A組、低于B組（圖2C）。各組大鼠OPN表達(dá)強(qiáng)度比較見(jiàn)表4，根據(jù)表4數(shù)據(jù)，采用多個(gè)組的獨(dú)立組對(duì)樣本分組進(jìn)行定量比較的方法Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，可以得出確定各組腎小管OPN表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其A組的OPN表達(dá)最少，B組的OPN表達(dá)最明顯，C組、D組、E組的OPN表達(dá)強(qiáng)度次之。C組、D組和E組組間比較，采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為C組、D組和E組組間的OPN表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠OPN表達(dá)強(qiáng)度（只）

圖2 各組大鼠腎臟OPN結(jié)果。A：A組髓質(zhì)OPN（×400）；B：B組髓質(zhì)OPN（×400）；C：C組、D組、E組髓質(zhì)OPN（×400）

討 論

腎結(jié)石的形成是一個(gè)復(fù)雜而隱匿的過(guò)程，多年來(lái)眾多學(xué)者提出了許多學(xué)說(shuō)，如腎鈣斑學(xué)說(shuō)、基質(zhì)學(xué)說(shuō)、免疫損傷學(xué)說(shuō)等［4］。目前研究認(rèn)為，腎結(jié)石的形成是一個(gè)多因素互相作用的結(jié)果，其中包括促進(jìn)因素，如基因易感性、體內(nèi)物質(zhì)代謝異常、腎解剖異常［5］，也包括檸檬酸、磷酸鹽、OPN等抑制因素［6-8］。腎結(jié)石主要成分包括草酸鈣結(jié)石（70%）、磷酸鈣結(jié)石（10%）、尿酸鈣結(jié)石（17%）及胱氨酸結(jié)石等［1］。草酸鈣結(jié)石最為常見(jiàn)，草酸鈣結(jié)石的全年發(fā)病率大概為每年占我國(guó)泌尿系結(jié)石總發(fā)病患者全年發(fā)病率的60%～80%［4］，研究解決草酸鈣結(jié)石臨床形成機(jī)制問(wèn)題尤其具有重要的學(xué)術(shù)科學(xué)性和重要臨床意義。

近幾年，國(guó)外學(xué)者通過(guò)對(duì)比結(jié)石患者飲用可樂(lè)、咖啡、蘇打水、檸檬酸飲料及正常飲食對(duì)結(jié)石形成作用的研究顯示，飲用檸檬酸飲料的尿量升高、尿枸櫞酸濃度增加、草酸鈣飽和度減低，尿酸濃度降低，降低了結(jié)石復(fù)發(fā)率等［9-10］。臨床系統(tǒng)評(píng)價(jià)也顯示檸檬預(yù)防腎結(jié)石的有效性［11］，且無(wú)不良作用。薔薇科杏屬植物烏梅為多年生草本植物，烏梅葉、果、根等均可入藥，傳統(tǒng)用于治療久咳、久瀉、虛熱煩渴、痢疾、便血、尿血等癥［12］。商英成等［13］通過(guò)雄性大鼠動(dòng)物學(xué)模型研究了烏梅對(duì)草酸鈣晶體生長(zhǎng)的抑制影響，發(fā)現(xiàn)烏梅提取液在草酸鈣晶體中的生成過(guò)程中具有抑制性作用，且其抑制性作用也會(huì)隨烏梅提取液中含水量和濃度的減少而進(jìn)一步增加。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，檸檬提取液、烏梅提取液和檸檬烏梅提取液都可以顯著降低腎結(jié)石大鼠尿液Ca2+、尿液OX、尿液UA等水平，提高尿液pH水平，增加大鼠的排尿量，提高Cr排泄，能有效抑制腎臟組織草酸鈣結(jié)晶的形成，降低血BUN和Cr含量。給予檸檬提取液、烏梅提取液和檸檬烏梅提取液后，組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腎臟組織內(nèi)草酸鈣結(jié)晶顯著程度減少，未見(jiàn)良性腎小管明顯厚度增大和小管擴(kuò)張，OPN表達(dá)強(qiáng)度降低。通過(guò)分析原因，可能是檸檬和烏梅中的枸櫞酸與鈣離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，減輕了腎臟的損傷，保護(hù)腎功能。通過(guò)OPN表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，檸檬烏梅提取液可能通過(guò)降低腎臟OPN的表達(dá)來(lái)抑制大鼠草酸鈣結(jié)晶的形成。而且C組、D組、E組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析顯示，檸檬提取液、烏梅提取液和檸檬烏梅提取液都能降低尿Ca2+，但檸檬烏梅提取液降低尿液Ca2+的功能明顯較強(qiáng)；檸檬提取液、烏梅提取液和檸檬烏梅提取液都能降低尿OX含量，但檸檬烏梅提取液降低尿液OX的功能明顯較強(qiáng)；檸檬提取液、烏梅提取液和檸檬烏梅提取液都能降低尿UA含量，但檸檬烏梅提取液降低尿液UA的功能明顯較強(qiáng)；檸檬提取液、烏梅提取液和檸檬烏梅提取液都能降低大鼠血液BUN的含量，且降低大鼠血BUN的功能一致；檸檬提取液、烏梅提取液和檸檬烏梅提取液都能降低大鼠血液Cr的含量，檸檬提取液和檸檬烏梅提取液降低大鼠血Cr的功能一致，而檸檬烏梅提取液降低大鼠血Cr的功能比烏梅提取液好。通過(guò)腎小管草酸鈣結(jié)晶分級(jí)結(jié)果，檸檬烏梅提取液抑制腎小管結(jié)晶生成能力比檸檬提取液、烏梅提取液強(qiáng)。分析其原因可能為檸檬和烏梅的協(xié)同作用，增強(qiáng)了枸櫞酸與鈣離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，大大減輕了腎小管草酸鈣結(jié)晶的生成。

綜上所述，檸檬烏梅提取液能有效抑制大鼠草酸鈣腎結(jié)石的形成，但檸檬烏梅提取液的有效活性成分和其更多的功能還有待進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突