飼料脂肪水平對大規(guī)格松浦鏡鯉越冬前后體質(zhì)量損失、體成分及脂代謝基因表達的影響

范 澤， 李晉南， 張圓圓， 吳 迪， 王連生

（中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江省水生動物病害與免疫重點實驗室，黑龍江哈爾濱150070）

越冬期是魚類養(yǎng)殖過程中一個特殊的階段，尤其是在我國“三北”（東北、華北、西北）地區(qū)。 在越冬過程中，養(yǎng)殖魚類通過改變生化、生理和分子活動狀態(tài)來應對越冬產(chǎn)生的食物匱乏和低溫冷應激 （Song 等，2019；Long 等，2013；Shoup 和 Wahl，2008）。 鯉魚作為池塘養(yǎng)殖的主要品種，其在“三北” 地區(qū)的年產(chǎn)量約占池塘養(yǎng)殖總量的50% ~60%（中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒，2020），因此深入研究越冬對鯉魚養(yǎng)殖過程中的影響是實現(xiàn)鯉魚健康養(yǎng)殖的基礎且必要工作。

越冬期間，魚類基礎代謝在水溫降低至4 ℃以下時顯著下降，攝食完全停止，僅僅依賴于體內(nèi)儲存的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生能量來維持基本生命活動（Xu等，2020；于淼等，2015；Fullerton 等，2011）。研究表明， 脂肪是鯉魚長期饑餓過程中主要的供能物質(zhì)（于淼等，2015）。 養(yǎng)殖實踐中往往在鯉魚越冬前投喂高脂飼料，進而提高體內(nèi)能量物質(zhì)的儲備確保安全越冬，但同時也造成了越冬期結束后鯉魚較高的死亡率及較弱的體質(zhì)（王釗，2017；NRC，2011）。 飼料脂肪的適宜添加水平與飼料營養(yǎng)配比、 生長階段、養(yǎng)殖環(huán)境等多種因素相關，目前，鯉魚越冬前投喂何種水平的脂肪飼料鮮見研究報道。

松浦鏡鯉于2008 年通過全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會審定，在十余年的推廣過程中，養(yǎng)殖規(guī)模和分布地域逐年擴大， 取得了良好的經(jīng)濟效益和社會效益，已成為我國鯉主要的養(yǎng)殖品種（石連玉等，2016）。在課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)，大規(guī)格松浦鏡鯉[（247.00±16.67）g]對飼料脂肪最適添加水平為6%。 本試驗在前期研究基礎上探討飼料脂肪水平對大規(guī)格松浦鏡鯉越冬前后生長、 體成分及脂代謝基因表達的影響， 探究飼料脂肪水平與鯉魚越冬的關系， 為鯉魚在北方越冬期及越冬后的健康養(yǎng)殖提供科學依據(jù)， 為開發(fā)利于鯉魚越冬的飼料奠定實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料 以魚粉、豆粕為蛋白質(zhì)源，豆油為脂肪源， 通過設置不同水平的豆油及次粉配制3%、6%、9%、12%、15%和 18% 6 組脂肪水平的試驗飼料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。 飼料制作在哈爾濱市合禾飼料有限責任公司完成， 首先將所有干性原料經(jīng)粉碎機后，過60 目篩，按逐級放大原則使用混勻機攪拌混勻， 后依據(jù)飼料配方比例加入豆油， 在混勻機中充分混合后使用飼料制粒機制成直徑為3.00 mm 的沉性顆粒飼料。

1.2 試驗魚及飼養(yǎng)管理 在進行完大規(guī)格松浦鏡鯉對飼料脂肪適宜需要量的研究試驗后（2019年10 月底），在每一個網(wǎng)箱中保留規(guī)格齊整、質(zhì)量為（609.70±49.93）g 的 20 尾大規(guī)格鯉魚進行越冬試驗，共 18 個網(wǎng)箱（2.0 m×2.0 m×2.0 m），越冬期間不投喂任何食物，只進行水溫檢測。越冬試驗時間為 2019 年 10 月 31 日至 2020 年 4 月 28 日。越冬期間水溫3 ~ 8 ℃。

1.3 樣本采集 越冬周期結束后對試驗魚進行計數(shù)并對所有試驗魚進行稱重， 以計算存活率及增重率；從每箱中隨機取3 尾魚，對其體長進行測量，以計算肥滿度；試驗魚于冰盤中迅速解剖取其肝胰臟及肌肉， 樣本轉入-20 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 指標測定及方法

1.4.1 生長指標計算

存活率/%=Nt/N0×100；

增重率/%=（mt-m0）/m0×100；

肥滿度/（g/cm3）=mt/Lt3；

肝體比/%=mh/mt×100；

式中：t 為試驗天數(shù)，d；Nt為終末存活尾數(shù)；N0為初始放養(yǎng)尾數(shù)；m0為平均初始體質(zhì)量，g；mt為平均終末體質(zhì)量，g；Lt為平均終末魚體長，cm；mh為肝胰臟質(zhì)量，g。

1.4.2 肌肉成分的測定 粗脂肪含量采用索氏抽提法（GB/T6433-1994）進行測定，水分及灰分分別采用常壓恒溫烘干法 （GB6435 -1986），550 ℃灼燒法進行測定（GB/T6438-2007）。

1.4.3 脂代謝相關基因的相對表達量測定 越冬周期結束后各組試驗魚饑餓24 h 后分別投喂各組飼料，在2 h 后每組隨機取3 尾魚，取其肝胰臟于液氮中研磨。利用Trizol 法提取各組織總RNA，參照TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time） （Code No：RR047A）說明書，將總RNA 反轉錄為cDNA。

根據(jù)Genbank 中現(xiàn)有的鯉魚脂肪酸合成酶（FAS2，HM802556.1）、 脂 蛋 白 脂 酶 （LPL2，F(xiàn)J436077）、 肉毒堿棕櫚酰轉移酶-1 （CPT-1，JF728839）、 固 醇 調(diào)節(jié) 元件 結 合蛋 白 （SREBP，KJ162572）、乙酰輔酶 A 羧化酶（ACC，GU908475）及β-actin 保守序列設計引物（表2）。 所有引物均由生工生物工程（上海）有限股份公司合成。

表2 試驗所用引物

實時熒光定量PCR 反應根據(jù)SYBRRPremix Ex Taq TM （Tli RNaseH Plus）（Code：RR420A）試劑盒說明書進行， 采用SYBR Green 染色法，在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System實時PCR 檢測系統(tǒng)下進行。 為了避免擴增批次間存在差異， 目的基因與其對應的內(nèi)參基因同時擴增，每個模板均做三個重復，得到三個Ct 值，取其平均值作為最終 Ct 值， 后運用比較 Ct 法（△△Ct） 對所得數(shù)據(jù)進行分析比較進而得到各模板中各基因的相對表達量，計算公式為：相對表達量=2-△△Ct=2-[（Ct 處理-Ct 內(nèi)參）-（Ct 對照-Ct 內(nèi)參）]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 所有數(shù)據(jù)均用Excel 2007 及SPSS 22 進行分析處理。利用Excel 軟件制作各指標的標準曲線， 并利用標準曲線計算得出各樣品中對應指標的活性含量。 所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示，并利用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），若差異達到顯著水平（P < 0.05），則進行Duncan‘s 法多重比較。

2 結果

2.1 飼料不同脂肪水平對松浦鏡鯉越冬后魚體質(zhì)量及存活率的影響 由表3 可以看出， 越冬前的8 周養(yǎng)殖試驗中，6%脂肪組的均重 （668.59 g）顯著高于 3%脂肪組 （587.69 g）、15%脂肪組（583.92 g）和 18%脂肪組（556.07 g）（P < 0.05），其增重率 （175.53%） 顯著高于其余各組 （P <0.05）。 越冬后，各脂肪水平組鯉魚體質(zhì)量呈現(xiàn)一定比例下降， 其中6%脂肪組的越冬后體質(zhì)量（613.77 g）顯著高于 3%脂肪組（506.05 g）、12%脂肪組 （525.04 g） 和 18%脂肪組 （494.87 g）（P <0.05），其體質(zhì)量損失率（8.25%）顯著低于3%脂肪組（13.90%）和 18%脂肪組（11.04%）（P < 0.05）。越冬存活率在各組間無顯著差異 （P > 0.05），6%脂肪組最高，為100.00%。

表3 飼料不同脂肪水平對松浦鏡鯉越冬后體質(zhì)量及存活率的影響

2.2 飼料不同脂肪水平對松浦鏡鯉越冬后形體指標的影響 由表4 可以看出， 各脂肪組的肥滿度和肝體比均表現(xiàn)出一定比例的下降。越冬前后，各組間肥滿度均無顯著差異（P > 0.05），肥滿度下降比以6%脂肪組（7.74%）為最低，以18%脂肪組（16.95%） 為最高。 越冬前，18%脂肪組的肝體比（2.44%） 顯著高于除15%脂肪組外的其余各組（P < 0.05）， 而越冬后，18%脂肪組的肝體比（2.44%） 顯著高于除9%和15%脂肪組外的其余各組（P < 0.05），各組間肝體比下降比無顯著差異（P > 0.05），以 6%脂肪組（19.69%）為最低。

表4 飼料不同脂肪水平對松浦鏡鯉越冬前后形體指標的影響

2.3 飼料不同脂肪水平對松浦鏡鯉越冬后肌肉和肝胰臟營養(yǎng)成分的影響 由表5 可以看出，各脂肪水平組越冬后肌肉粗蛋白質(zhì)呈現(xiàn)一定比例的下降， 其中6%脂肪組越冬后肌肉粗蛋白質(zhì)含量（13.36%）最高，顯著高于15%組（12.28%）和18%組（11.28%），且其下降率為最低（13.08%），顯著低于 3%組 （32.32%） 和 18%組 （20.58%）（P <0.05）。 各脂肪水平組越冬后肌肉粗脂肪呈現(xiàn)一定比例的下降， 以3%脂肪組的肌肉粗脂肪含量（0.80%）為最低，顯著低于其余各組（P < 0.05），而15%組（1.00%）和18%組（1.01%）的肌肉粗脂肪含量顯著低于6%、9%和12%三組 （P < 0.05）。6%組（36.06%）和9%組（37.05%）的肌肉粗脂肪下降比顯著低于其余各組 （P < 0.05）。 各脂肪水平組越冬后肝胰臟粗脂肪呈現(xiàn)一定比例的下降，越冬后以18%脂肪組的肝胰臟脂肪含量（7.73%）顯著高于除15%組外的其余各組 （P < 0.05），其下降比 （30.33%） 亦顯著高于其余各組 （P <0.05）。 各脂肪組越冬后肌肉水分呈現(xiàn)一定比例的增加，以3%脂肪組的肌肉水分含量（84.12%）為最高，顯著高于 6%組（78.58%）（P < 0.05），其增加比（8.72%）亦顯著高于其余各組（P < 0.05），水分增加比最低的為3%脂肪組（0.53%），顯著低于除9%組外的其余各組（P < 0.05）。

表5 飼料不同脂肪水平對松浦鏡鯉越冬前后肌肉和肝胰臟營養(yǎng)成分的影響 %

2.4 飼料不同脂肪水平對松浦鏡鯉越冬后脂代謝相關基因表達的影響 由表6 可以看出， 脂肪合成相關的FAS、ACC1 及SREBP 的基因表達量均以6%組為最高， 其中FAS 表達量顯著高于其余各組（P < 0.05），ACC1 的基因表達量顯著高于3%、15%及 18%組（P < 0.05），SREBP 的基因表達量與其他各組無顯著差異（P > 0.05）。脂肪分解相關的CPT1 的基因表達量3%組和6%組顯著低于其余各組（P < 0.05），而LPL 基因表達量在各組間無差異（P > 0.05）。

表6 飼料不同脂肪水平對松浦鏡鯉越冬后脂代謝相關基因表達的影響

3 討論

在德國鏡鯉選育系基礎上進一步培育出的松浦鏡鯉，在鱗被、生長及抗逆抗病方面都有著較為顯著的提高（于淼，2015）。 于淼等（2015）從形態(tài)學、 組織學及生化組成等三方面綜合分析了松浦鏡鯉在越冬期間發(fā)生的變化。 本試驗從體質(zhì)量損失、形態(tài)學指標、肌肉及肝胰臟營養(yǎng)成分組成及脂代謝相關基因表達初步探討越冬前飼料脂肪供給水平對鯉魚越冬的潛在影響。

本試驗結果表明， 越冬前飼料脂肪水平為6%時可有效降低大規(guī)格松浦鏡鯉 [（609.70±49.93）g]越冬后體質(zhì)量損失率，而在前期的試驗中發(fā)現(xiàn)， 同規(guī)格松浦鏡鯉的適宜脂肪需求量也為6%。 武文一（2020）研究發(fā)現(xiàn)，越冬前飼料強化適宜蛋白（31%）和適宜脂肪（4%）水平飼料可有效降低草魚越冬后體重損失率， 而當飼料脂肪水平為8%時反而會提高體重損失率。 說明無論是養(yǎng)殖階段還是越冬期過高的脂肪攝入均會帶來潛在的脂質(zhì)過氧化應激，進而提升體質(zhì)量損失率。養(yǎng)殖實踐中肥滿度、 肝體比常作為評估魚體生理生化或營養(yǎng)狀況的參考指數(shù) （賈明亮，2010；Froese，2006）。 于淼 （2015） 發(fā)現(xiàn)， 越冬后松浦鏡鯉[（248.87±15.75）g]的肥滿度降低比達到 23.26%，肝體比下降達到29.59%。 而在本試驗中，越冬后各脂肪組的肥滿度下降比為7.74% ~ 16.95%，肝體比下降比為19.69% ~ 26.07%，均以6%脂肪組為最低，因此從生物學性狀來看，越冬前飼料脂肪水平為6%可使松浦鏡鯉能量沉積狀況處于較好狀態(tài)（黃春紅等，2015）。 這種差異可能主要源于：（1） 本研究中松浦鏡鯉越冬前體質(zhì)量較于淼（2016）試驗中的松浦鏡鯉重400 余克，規(guī)格差異影響了二者越冬后的形態(tài)學指標， 即魚規(guī)格大且肥滿度高，則越冬效果好（Fullerton 等，2011）。 （2）越冬前飼料脂肪供給會影響魚類越冬后形態(tài)學指標。武文一（2020）發(fā)現(xiàn)相較于4%脂肪組，8%脂肪組草魚會獲得更低的肥滿度和肝體比。 結合本試驗的結果來看， 過高或過低的脂肪水平都會影響機體形態(tài)學指標， 進而反映魚體生理生化或營養(yǎng)狀況的異常。

魚類在越冬期間面對的是低溫冷應激 （4 ℃以下）和食物匱乏的雙重壓力，僅僅依賴于體內(nèi)儲存的營養(yǎng)物質(zhì)維持基本生命活動。 因此魚體營養(yǎng)成分的變化能夠較好地反映出內(nèi)源營養(yǎng)在越冬期的利用規(guī)律（Li 等，2018）。 于淼（2015）研究脂肪的消耗貫穿整個越冬饑餓期， 蛋白質(zhì)在越冬饑餓后期才進行消耗， 且越冬后肌肉蛋白質(zhì)含量與體質(zhì)量損失率成顯著負相關， 說明越冬后肌肉蛋白質(zhì)水平能體現(xiàn)越冬期體重損失程度， 這種營養(yǎng)物質(zhì)利用的順序規(guī)律與草魚相似 （Gong 等，2017）。本試驗同樣發(fā)現(xiàn)， 各脂肪組肌肉及肝胰臟粗脂肪含量、肌肉蛋白質(zhì)含量均出現(xiàn)一定比例的下降，下降比分別為36.06% ~ 67.18%、11.06% ~ 30.33%及13.08% ~ 32.32%， 均以6%脂肪組為最低，肌肉及肝胰臟粗脂肪下降比均以18%脂肪組為最高， 肌肉粗蛋白質(zhì)含量下降比以3%脂肪組為最高， 這表明越冬前不適宜的飼料脂肪供給非但不能降低營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和體重損失率的下降，反而可能會促進更多的營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和動員，進而影響魚體對越冬環(huán)境的營養(yǎng)物質(zhì)消耗策略 （石桂城等，2012）。6%脂肪組在越冬后保持了較高的肌肉蛋白質(zhì)和粗脂肪含量， 消耗了更少的能量物質(zhì)，更利于維持體質(zhì)，便于越冬后機體代謝能力的恢復（武文一，2020）。 與于淼（2015）對松浦鏡鯉[（248.87±15.75）g]的研究結果相比，本試驗中各脂肪組松浦鏡鯉的肌肉粗蛋白質(zhì)含量下降比均較高， 這表明規(guī)格差異可能是影響越冬過程中松浦鏡鯉營養(yǎng)物質(zhì)利用的關鍵因素。此外，越冬期間各試驗組松浦鏡鯉肌肉水分含量明顯增加， 原因可能是肌肉中蛋白質(zhì)和脂肪分解代謝后釋放出的空間會被體液所填充， 致使肌肉水分含量升高（Wu等，2020；Kojima 等，2015）。

魚類生長是機體合成代謝不斷積累的結果，低溫冷應激除了通過限制魚體攝食和消化吸收功能， 減少合成代謝所需的營養(yǎng)原料而降低魚類的生長速度外（魯棟梁，2019），還會影響機體內(nèi)源營養(yǎng)物質(zhì)的合成能力（辛芳等，2016）。魯棟梁（2019）研究發(fā)現(xiàn)， 脂肪分解代謝激活劑Fenofibrate 的使用促進了斑馬魚脂肪分解代謝的效率， 提高了斑馬魚的短期冷應激耐受；與之相反，脂肪分解代謝抑制劑Mildronate 的使用抑制了斑馬魚脂肪分解的效率并降低了斑馬魚的短期冷應激耐受能力，表明脂肪的分解利用是魚類應對短期冷應激的主要供能途徑。對草魚的研究發(fā)現(xiàn)，越冬后脂肪合成基因表達受到影響，如脂肪酸合成酶（FAS），乙酰輔酶A 羧化酶 （ACC）， 硬脂酰輔酶 A 去飽和酶（SCD），長鏈酰基 CoA 合成酶（ACSL）；同時脂質(zhì)分解基因表達水平顯著上調(diào)， 如激素敏感脂酶（HSL），乙酰 CoA 乙酰基轉移酶（ACAT）等。 表明草魚在越冬期間嚴格限制脂質(zhì)合成同時加速脂質(zhì)分解供能 （武文一，2020；Zaarur 等，2019；Mar-queze 等，2018）。 在本試驗中，越冬后 6%脂肪組松浦鏡鯉的FAS、ACC1 和SREBP 基因表達量更高，CPT1 和LPL 基因表達量更低，魚體的脂肪動員模式較為合理， 表明越冬前適宜的飼料脂肪供給能夠顯著增強機體脂肪合成能力， 有助于機體在越冬期間自身內(nèi)源脂肪的合成， 降低蛋白質(zhì)用于供能的比例， 這與肌肉粗蛋白質(zhì)及粗脂肪含量下降結果相吻合。此外，與魯棟梁（2019）的短期低溫冷應激試驗不同，越冬后出池水溫逐漸上升，鯉能攝取底泥中殘留的營養(yǎng)物質(zhì)， 機體所需脂肪合成的營養(yǎng)原料逐步充足（于淼，2015），進而增強脂肪合成能力。 但飼料脂肪調(diào)控越冬期松浦鏡鯉的肝胰臟脂代謝的具體作用機制仍需進一步研究。

4 結論

在整個越冬期， 飼料脂肪水平為6%時能夠使體質(zhì)量損失率及肥滿度降低比最小化， 在越冬后保持較高的肌肉蛋白質(zhì)和粗脂肪含量， 消耗更少的能量物質(zhì)， 使魚體自身內(nèi)源脂肪合成能力增強而分解能力減弱，更利于維持體質(zhì)，便于越冬后饑餓后機體代謝能力的恢復。