超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中維生素D3

程傳民 ， 李 云 ， 谷 明 ， 徐定慧 ， 鄺婷婷 ，王宇萍 ， 馮 波 ， 趙立軍 ， 張 靜 ， 童 琪

（1.四川省飼料工作總站，四川成都 610041；2. 阿壩藏族羌族自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局種子站，四川阿壩藏族羌族自治州 624009；3.四川省草原科學(xué)研究院，四川成都 611731）

維生素D3的基本功能是參與體內(nèi)鈣、 磷代謝，促進(jìn)腸道鈣、磷吸收，調(diào)整鈣、磷吸收比例，促進(jìn)骨的鈣化和正常發(fā)育（Cashman 和Kiely，2016；Spiro 和 Buttriss，2015；Jetter 等 ，2014；Cashman等，2012；Borradake 和 Kimlin，2009）。 缺乏維生素D3，即使鈣、磷充足，也不能在骨骼中很好的沉積；維生素D3過(guò)量可產(chǎn)生過(guò)多癥（Martinez 等，2017；Rodeny 等 ，2017；Zhou 等 ，2016；Hines 等 ，2013；Lauridsen 等，2010），表現(xiàn)為血鈣過(guò)多，組織、器官鈣鹽沉積，骨骼易折（劉亞楠等，2020；徐宏建等，2020；Duffy 等 ，2018；Ren 等 ，2018；Rodney 等 ，2018；Duffy 等，2017）。 因此準(zhǔn)確檢測(cè)飼料中維生素D3十分必要。

現(xiàn)行的飼料中維生素 D3檢測(cè)方法（GB/T 17818—2010）為液相色譜法，出峰時(shí)間有其他物質(zhì)干擾，無(wú)法準(zhǔn)確定量；需要進(jìn)行色譜柱的二次分離，檢測(cè)效率較低；且該方法檢出限較高不適用于飼料原料中維生素D3的檢測(cè)。 本研究擬采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)內(nèi)標(biāo)法解決上述問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 1290/6495 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧源，美國(guó)Aglient 公司）；維生素D3、維生素D2標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó) Dr. Ehrenstorfer 公司）；甲醇（色譜純，美國(guó) Fisher Scientific 公司）； 甲酸 （色譜純，F(xiàn)luka 公司），Bond Elut ENN固相萃取柱 （美國(guó)Agilent 公司）、Bond Elut Plexa固相萃取柱 （美國(guó) Agilent 公司）；Captiva EMRLipid 凈化柱（美國(guó) Agilent 公司）

飼料樣品：豬配合飼料、禽配合飼料、濃縮飼料、飼料原料。

1.2 溶液配制 維生素D3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱(chēng)取10 mg維生素D3（膽鈣化醇）標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL 棕色容量瓶中， 用色譜純無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，混勻，-20 ℃保存。該儲(chǔ)備液濃度為 200 μg/mL，有效期3 個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)中間液： 取1.00 mL 儲(chǔ)備液用色譜純無(wú)水乙醇定容到100 mL 容量瓶，-20 ℃保存， 該中間液質(zhì)量濃度2.0 μg/mL，有效期1 個(gè)月。

維生素D2內(nèi)標(biāo)工作液： 稱(chēng)取100 mg 維生素D2（鈣化醇）標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 棕色容量瓶中，用色譜純無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，混勻，該液濃度為 1.0 mg/mL。 用甲醇稀釋 10 倍，配制成 100 μg/mL內(nèi)標(biāo)工作液。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確吸取維生素D3標(biāo)準(zhǔn)中間液 0.10、0.20、0.50、2.50、5.00、12.50 mL 于 100 mL棕色容量瓶中， 各加入維生素D2內(nèi)標(biāo)工作溶液1.00 mL，用甲醇定容至刻度，混勻。此標(biāo)準(zhǔn)系列工作液濃度分別為 2.0、4.0、10.0、50、100、250 μg/L。

1.3 色譜和質(zhì)譜條件 Thermo BDS HYPERSIL C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.4 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；流速：300 μL/min；流動(dòng)相梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

離子源：電噴霧離子源；掃描模式：正模式；毛細(xì)管電壓：正模式3500 V；負(fù)模式：3000 V；干燥氣溫度：250 ℃；干燥器流速：10 L/min；霧化氣壓力：35 psi；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速 11 L/min；EMV：300 V。監(jiān)測(cè)離子對(duì)（m/z）和其他參考條件參見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜選擇反應(yīng)監(jiān)控參數(shù)

1.4 樣品前處理?xiàng)l件 稱(chēng)取2 g 試樣于50 mL具塞離心管中， 加入100 μL 維生素D2內(nèi)標(biāo)工作溶液（100 μg/mL）和 0.4 g 抗壞血酸，加入 6 mL約 40 ℃溫水，渦旋 1 min，加入 12 mL 乙醇，渦旋30 s，再加入 6 mL 氫氧化鉀溶液（500 g/L），渦旋30 s 后， 放入恒溫振蕩器中，80 ℃避光恒溫水浴振蕩30 min，取出放入冷水浴降溫。

向冷卻后的皂化液中加入20 mL 正己烷，渦旋提取3 min，7000 r/min 條件下離心3 min。轉(zhuǎn)移上層清液到50 mL 離心管，加入25 mL 水，輕微晃動(dòng)30 次，在7000 r/min 條件下離心3 min，取上層有機(jī)相在40 ℃下氮?dú)獯蹈桑?加入體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇溶液5.0 mL，備用。

用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇水溶液2 mL 活化凈化小柱Bond Elut Plexa，全部樣液上柱，再用80%的甲醇水溶液2 mL 淋洗小柱， 抽干，4 mL 丙酮洗脫，40 ℃氮?dú)獯蹈桑? mL 甲醇復(fù)溶，過(guò)膜，供 LCMS/MS 檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 皂化和提取條件的研究 目前， 維生素D3檢測(cè)過(guò)程中影響檢測(cè)效率的主要因素是皂化和提取過(guò)程，本研究在不改變?cè)砘淼那疤嵯拢ㄟ^(guò)將回流改成水浴振蕩，乙醚提取改成正己烷提取，減少提取次數(shù)和洗滌次數(shù)， 采用實(shí)際樣品與標(biāo)準(zhǔn)方法比較提取效率，結(jié)果能夠滿(mǎn)足要求。

2.2 凈化條件的優(yōu)化 根據(jù)維生素D3的化學(xué)性質(zhì)，選取吸附特性為非極性的凈化小柱Bond Elut ENN 和Bond Elut Plexa。 同時(shí)比較了吸附雜質(zhì)性固相萃取柱Captiva EMR-Lipid。考察凈化小柱的回收率。 其中，Bond Elut ENN 小柱回收率低于50%，Captiva EMR-Lipid 凈化效果不明顯，通過(guò)優(yōu)化固相小柱凈化條件，Bond Elut Plexa 凈化小柱回收率達(dá)可到90%左右，通過(guò)液相考察維生素D3色譜峰峰型對(duì)稱(chēng)，峰純度高，由此可見(jiàn)，Bond Elut Plexa 小柱可以實(shí)現(xiàn)飼料中維生素D3的凈化。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)考察 基質(zhì)常常對(duì)分析物的分析過(guò)程有顯著的干擾（陳小華和汪群杰，2009）。基質(zhì)效應(yīng)主要是由質(zhì)譜檢測(cè)器的離子化過(guò)程產(chǎn)生的，在電噴霧時(shí)， 基質(zhì)內(nèi)的組分與目標(biāo)化合物共同流出噴霧針，影響目標(biāo)物的霧化、揮發(fā)、分裂、化學(xué)反應(yīng)及帶電過(guò)程，致使進(jìn)入質(zhì)譜的離子減少或增加，從而影響定量分析的可靠性和準(zhǔn)確性 （蘇萌和艾連峰，2014；王立琦等，2011）。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物響應(yīng)存在明顯的增強(qiáng)作用， 因此在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中， 用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量會(huì)對(duì)回收率造成影響。 在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法中，補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)的方法有基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的校正、 同位素標(biāo)記法、加入分析保護(hù)劑、優(yōu)化進(jìn)樣技術(shù)等（劉洪斌等，2011；蔣施等，2010），本實(shí)驗(yàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯，因此采用維生素D2作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，在經(jīng)濟(jì)條件較好的情況下，可以采用維生素D3的同位素內(nèi)標(biāo)。

2.4 色譜柱的選擇 維生素D3在一般的C18 色譜柱上有較好的保留，本方法比較了Waters ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm ×50 mm，1.7 μm）、Agilent SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）和Thermo BDS HYPERSIL C18 （2.1 mm× 100 mm，2.4 μm）色譜柱，經(jīng)使用標(biāo)準(zhǔn)工作液對(duì)各規(guī)格色譜柱進(jìn)樣分離得色譜質(zhì)譜圖。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，在本研究的液相條件下，Thermo BDS HYPERSIL C18（2.1 mm×100 mm，2.4 μm） 色譜柱峰型和靈敏度較好。 標(biāo)準(zhǔn)液的特征離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 維生素D3 和維生素D2 標(biāo)準(zhǔn)品的特征離子色譜圖（MRM）

2.5 流動(dòng)相選擇 為了實(shí)現(xiàn)VD3峰型對(duì)稱(chēng)、響應(yīng)高的要求，本研究采用常用的甲醇-水做流動(dòng)相，為增加VD3的離子化效率，在水相中加入體積分?jǐn)?shù)0.2%的甲酸，經(jīng)比較使用不同比例的甲醇進(jìn)行洗脫，甲醇比例為95%（V：V）時(shí)最為理想，且能夠在較短時(shí)間內(nèi)得到很好的峰型； 甲醇比例更高時(shí)響應(yīng)明顯下降。本方法最終確定用0.2%的甲酸和甲醇做流動(dòng)相（表1）。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 方法的線(xiàn)性、檢出限和定量限 維生素D3在MRM 方式下的靈敏度除取決于本身的結(jié)構(gòu)原因外， 主要與離子化的效率有關(guān)。 本方法采用以空白樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的3 倍信噪比（S/N）為方法的檢出限；將特定濃度的維生素D3加入到空白樣品中，然后按本方法對(duì)樣品預(yù)處理。 經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，得本方法的定量限。具體曲線(xiàn)方程、檢出限和定量限見(jiàn)表3。

表3 線(xiàn)性方程、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.6.2 方法準(zhǔn)確度與精密度 為考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，采用不同樣品基質(zhì)進(jìn)行了添加實(shí)驗(yàn)，按照定量限、 中間濃度和實(shí)際添加濃度進(jìn)行3 個(gè)梯度的添加，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4 所示。平均回收率為70.1% ~ 93.6%，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8% ~8.3%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.1% ~ 6.9%，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表4 方法精密度與準(zhǔn)確度

2.6.3 實(shí)際樣品檢測(cè) 選擇5 份含有維生素D3的仔豬配合飼料， 按本方法優(yōu)化條件進(jìn)行前處理后分別上液相和LC-MS/MS 測(cè)定，液相色譜峰保留時(shí)間處未見(jiàn)雜質(zhì)峰干擾， 可見(jiàn)本研究前處理方法也可用于液相檢測(cè)。 液相結(jié)果和LC-MS/MS 結(jié)果相對(duì)偏差小于10%， 均在理論含量偏差范圍內(nèi)。表明本方法具有實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

3 結(jié)論

本研究采用更加便捷的皂化法提取， 用固相萃取法進(jìn)行凈化，內(nèi)標(biāo)法定量分析，建立了液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)飼料中維生素D3含量的分析方法。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 該方法的檢出限為2.0 μg/kg，定量限為 5.0 μg/kg；在 2 ~ 250 μg/kg定量范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好（r>0.995）；添加回收率為 70.1% ~ 93.6%；RSD＜10%。 方法批量操作性強(qiáng)，靈敏度高，具有較好的精密度與準(zhǔn)確度。