雜交構樹青貯對務川白山羊瘤胃微生物區系的影響

李世歌 ， 陳光吉 ，2， 李小冬 ， 鄒曉敏 ， 何潤霞 ， 張 坤 ，尚以順 ， 張 蓉 ， 熊先勤 ，2 ， 王子苑 ， 冉 賢

（1.貴州省農業科學院草業研究所，貴州貴陽 550006；2.貴州陽光草業科技有限責任公司，貴州獨山 558200；3.務川仡佬族苗族自治縣畜牧水產服務中心，貴州務川564300；4.貴州務川科華生物科技有限公司，貴州務川564300）

近年來，我國居民對畜禽產品的消費量需求增長強勁， 特別是牛羊肉在飲食結構中比例增加，促進了畜牧業，尤其是牛羊產業快速發展，加之新冠肺炎疫情和中美貿易摩擦影響，國際大宗飼草飼料價格上漲，使我國飼草和蛋白質飼料資源缺乏問題愈顯突出。因此，開發新型蛋白質粗飼料資源，發展節糧型畜牧業已是迫在眉睫。 構樹（Broussonetia papyrifera）又名楮桃，被子植物門雙子葉植物綱蕁麻目桑科構樹族構屬的落葉喬木。中科院通過種間雜交育種培育的雜交構樹，具有速生、抗逆強、輪伐期短、高產的特點（王麗，2019），是目前在我國推廣種植較為廣泛的新品種。 雜交構樹營養價值高，含有豐富的粗蛋白質、粗脂肪、氨基酸、維生素和微量元素，其葉片粗蛋白質含量高達19.22%~26.10%，全樹綜合利用枝葉混合物粗蛋白質含量為17%左右（張紅等，2020；劉祥圣等，2019；左鑫等，2018），與苜蓿干草相當。 此外，構樹葉中含有黃酮類化合物、生物堿、揮發油類、不飽和脂肪酸等生物活性物質，可在動物體中發揮抗菌、抗炎、增強免疫力、抗氧化等功能性作用（Dong 等，2020；Park 等，2016）。可見，雜交構樹是一種極具開發價值的高蛋白質非常規木本飼料。

瘤胃是反芻動物特有的消化器官， 內含大量的瘤胃微生物， 其使反芻動物能夠高效消化利用植物性蛋白、多糖和纖維素等，為機體提供必要的營養物質（崔浩然等，2021；楊艷等，2020）。瘤胃微生物的種類和豐度受動物的品種、年齡、飼料、生理階段、健康狀況等多種因素影響，其中飼糧組成和結構是瘤胃微生物最大的影響因素之一 （馬健等，2020）。董春曉等（2019）研究表明，不同粗飼料改變了湖羊的瘤胃細菌群落結構， 相比于玉米秸稈、玉米芯和葵花籽殼，油菜秸稈使瘤胃微生物的物種豐富度和多樣性更高。 李希等（2021）的研究結果顯示， 適量提高日糧中纖維水平能夠促進羔羊瘤胃中部分纖維降解菌的增殖。 陳麗娟等（2020）在不同比例的苜蓿和構樹為底物的瘤胃液體外發酵試驗中發現， 高比例構樹提高了變形桿菌門的豐度，高比例苜蓿提高了廣古菌門豐度。圣平等（2021）在日糧中添加雜交構樹飼喂湖羊，其瘤胃中擬桿菌門的相對豐度升高， 厚壁菌門的相對豐度則降低。研究表明，瘤胃微生物的變化與瘤胃發酵和生產效率密切相關 （Li 等，2019； 王海榮，2006；Shabat 等，2016）。然而，不同比例雜交構樹青貯和青貯玉米的混合日糧對肉羊瘤胃微生物群落結構的影響還鮮見報道。 本試驗旨在研究雜交構樹青貯替代不同比例的青貯玉米對務川白山羊的瘤胃微生物群落結構的影響， 為雜交構樹青貯在肉羊養殖中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 雜交構樹由務川縣桃符構樹產業孵化園提供， 刈割高度1.5 m 左右， 留茬高度20 cm 左右，第一茬刈割，粉碎至2 ~ 3 cm，制作為裹包青貯于常溫條件下發酵60 d 后逐包取用，每包重約50 kg。 試驗羊采購自務川縣養殖企業，系貴州地方山羊品種。

1.2 試驗設計 選取64 只4 月齡體重為（12.40±2.00）kg 的健康務川白山羊， 隨機分為 4組，每組 16 只羊（公母各半，分開飼養）。CS 組（對照組）不添加雜交構樹青貯；LBP 組雜交構樹青貯替代20%青貯玉米；MBP 組雜交構樹青貯替代50%青貯玉米；BPS 組雜交構樹青貯替代100%青貯玉米。各組日糧精粗比一致，雜交構樹青貯和青貯玉米的比例為唯一變量。 日糧組成與營養水平見表1。

表1 日糧組成及營養水平（干物質基礎） %

1.3 飼養管理 試驗羊采用高床羊舍舍飼，人工飼喂。試驗前對羊舍全面清掃消毒，試驗羊逐只稱重、驅蟲、打耳標。 每天 8：00 和 17：00 定時飼喂，精料和粗料混合均勻后飼喂，自由飲水，每天記錄各組飼糧添加量和前一天剩料量。 預飼期15 d，試驗期172 d。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 瘤胃液的采集與處理 正式期最后1 d 晨飼前，每組隨機選擇6 只試驗羊（公母各3 只），用真空泵瘤胃液采集器（2XZ-1，上海凱清）經口腔采集瘤胃液20 mL，經4 層無菌紗布過濾后，-80 ℃冷凍保存用于瘤胃微生物區系測定。

1.4.2 務川白山羊瘤胃微生物基因組DNA 提取和PCR 擴增 按照腸道內容物、糞便基因組提取試劑盒說明書對試驗樣品進行DNA 提取，提取的DNA 采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳進行質量檢測，使用引物 341F，5‘-CCTACGGGNGGCWGCAG-3‘，805R，5‘ -GACTACHVGGGTATCTAATCC -3‘ 對16S rDNA 可變區（V3+V4）進行 PCR 擴增。 PCR 擴增采用 25 μL 程序：Pusion Hot start flex 2X Master Mix 12.5 μL，1 μmol/L 的上、 下游引物各 2.5 μL，DNA 模板 50 ng，補加雙蒸水（ddH2O）至 25 μL；擴增條件：98 ℃持續 40 s 后進行 32 個循環， 依次為98 ℃ 30 s、98 ℃ 10 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，最后在72 ℃下延長10 min。PCR 擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目標片段進行回收，回收采用AMPure XT beads 回收試劑盒。

1.4.3 Miseq 測序 將樣品送至聯川生物技術有限公司運用Illumina MiSeq 平臺進行Miseq 測序。

1.5 數據統計分析 試驗數據采用EXCEL 2010初步處理后， 并采用SPSS 22.0 統計軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），Duncan’s 法進行多重比較，以P ＜0.05 作為差異顯著性的判斷標準。

2 結果

2.1 OTU 水平分析 基于 OTU 的 Venn 圖顯示，16S rDNA 基因測序共獲得 6861 個 OTUs，4組之間共有 4413 個 OTUs，CS、LBP、MBP 及 BPS組特有的 OTUs 分別為 63、34、33、91（圖 1）。

圖1 基于OTU 水平的Venn 圖

2.2 Alpha 多樣性分析 由表2 可知， 按照97%的序列相似度水平， 各處理組的OTU 數目和α-多樣性指數各異。 其中BPS 組、MBP 組務川白山羊瘤胃微生物的 OTU 數量分別比 CS 組高20.99%和 13.14%（P ＜ 0.05），Chao1 指數分別比CS 組高 20.83%和 12.15%（P ＜ 0.05）；BPS 組的Observed_species 指數和Shannon 指數分別比CS組高 27.23%和 9.73%（P ＜ 0.05）， 比 LBP 組高14.17%和 8.11%（P ＜ 0.05）；其他組間差異不顯著（P ＞0.05）。 覆蓋度反映樣品的測序深度，所有樣品覆蓋度均在0.98 以上，表明本次測序結果可以反映樣本的真實情況。

表2 瘤胃液細菌OTU 數目及Alpha 多樣性指數

2.3 聚類分析 基于Unweighted UniFrac 的加權主坐標分析，主成分1（PCo1）貢獻率為12.99%，主成分 2（PCo2）貢獻率為 10.17%，CS 組和 BPS 組山羊瘤胃微生物菌群組成差異明顯，飼喂相同日糧山羊的瘤胃微生物菌群可以很好的聚合在一起，微生物群落相似度較高（圖2）；基于OTU 分析結果，利用非加權組平均法構建UPGMA 聚類樹， 結果顯示，LBP 組和 MBP 組細菌群落結構較相似，CS 組和BPS 組細菌群落結構差異較大（圖3）。

圖2 基于非加權距離的PCoA 分析

圖3 基于非加權距離UPGMA 聚類樹分析

2.4 瘤胃細菌群落組成分析

2.4.1 雜交構樹青貯對務川白山羊瘤胃菌群門水平結構的影響 由表3 可知， 共檢測到20 種菌門，包括擬桿菌門、厚壁菌門、疣微菌門、變形菌門、未分類菌門、黏膠球形菌門、絲狀桿菌門、螺旋體門、暫定螺旋體門、迷蹤菌門、藍藻菌門、軟壁菌門、互養菌門、浮霉菌門、放線菌門、廣古菌門、SR1 門、綠彎菌門、酸桿菌門、裝甲菌門。各組山羊瘤胃細菌主要為擬桿菌門、厚壁菌門、疣微菌門和變形菌門，4 種菌門合計占總細菌的91.37% ~92.26%。 與CS 組相比，隨著雜交構樹青貯比例的增加， 擬桿菌門的相對豐度呈先升高后降低的趨勢， 且BPS 組的擬桿菌門相對豐度分別比CS 組和 MBP 組低 15.89%和 20.17%（P ＜ 0.05），MBP組暫定螺旋體門的相對豐度分別比CS、LBP 和BPS 組低 55.95%、48.61%和 44.78%（P ＜ 0.05）；LBP 組、MBP 組和BPS 組瘤胃液中酸桿菌門的相對豐度顯著高于 CS 組（P ＜ 0.05）。 其他各組菌門的相對豐度無顯著差異（P ＞0.05）。

表3 雜交構樹青貯對務川白山羊瘤胃細菌群落門水平相對豐度的影響 %

2.4.2 雜交構樹青貯對務川白山羊瘤胃細菌屬水平結構的影響 由表4 可知，4 組山羊瘤胃液菌群共包含230 個屬，其中有13 個菌屬相對比例均占總菌數的1%以上，分別為普雷沃菌屬、未分類擬桿菌屬、未分類瘤胃球菌科、位置未定的亞門5屬、未分類紫單胞菌科、未分類的擬桿菌目、理研菌屬、未分類細菌、梭菌屬、解琥珀酸菌屬、瘤胃球菌屬、克里斯滕森菌屬、未分類的毛螺菌科。 BPS組瘤胃液中的普雷沃菌屬相對豐度分別比CS 組和 MBP 組低 39.86%和 39.25%（P ＜ 0.05）；LBP、MBP 和BPS 組的未分類毛螺菌科相對豐度分別比 CS 組低 29.49%、44.70%和 38.25%（P ＜ 0.05）。

表4 雜交構樹青貯對務川白山羊瘤胃細菌屬水平相對豐度的影響 %

3 討論

作為反芻動物的重要消化器官， 瘤胃主要依靠各類瘤胃微生物的代謝活動來實現飼料的消化和營養代謝。 瘤胃微生物的群落結構受多種因素影響， 其中日糧的變化是影響瘤胃微生物區系的重要因素。 Alpha-多樣性反映微生物群落的豐富度和多樣性，Observed_species 指數和Chao1 指數反映樣本中菌群豐富度，數值越大，豐富度越高；Shannon 指數和Simpson 指數則用于估計瘤胃微生物的豐富度，Shannon 指數越大，Simpson 指數越低， 說明微生物群落多樣性越高。 本試驗中，MBP 組和 BPS 組的 OTU 數目、Observed_species指數和 Chao1 指數顯著高于 CS 組，BPS 組的Shannon 指數顯著高于 CS 組和 LBP 組， 而 LBP組和CS 組間的Alpha-多樣性指標無顯著差異，表明低比例的雜交構樹青貯對務川白山羊的瘤胃微生物菌群多樣性無顯著影響， 但隨著雜交構樹青貯比例的提高， 瘤胃微生物群落結構呈現更高的多樣性。圣平等（ 2021）在青貯雜交構樹替代花生秸稈飼喂湖羊的試驗中發現， 瘤胃中細菌群落的豐富度和多樣性未見顯著差異， 結果與本研究不同， 這可能是基礎日糧組成和動物品種不同所致，說明雜交構樹青貯的應用研究尚不充分。Beta多樣性和聚類分析反映了各組樣本間的相似性，分析可知， 各個樣本大致根據試驗處理不同而相互聚集在一起，CS 組與雜交構樹青貯各組在主坐標分析圖上距離較遠， 說明高比例的雜交構樹青貯改變了瘤胃細菌多樣性。

反芻動物瘤胃中的優勢菌門是擬桿菌門和厚壁菌門（Malaník 等，2020；Niu 等，2016）。 本試驗中各組的擬桿菌門為第一優勢菌群， 厚壁菌門的總量位居第二， 兩者豐度之和占瘤胃微生物總量的80%以上，與前人研究結果一致（陳麗娟等，2020；李與琦等，2020）。 擬桿菌門主要參與蛋白質和非纖維素植物多糖的分解（Pitta 等，2014），厚壁菌門是反芻動物瘤胃中降解纖維素的主要微生物（Klieve 等，2016）。本研究中，隨著日糧中雜交構樹青貯比例的提高，擬桿菌門的相對豐度隨之提高，以MBP 組最高，這是由于雜交構樹青貯比例的提高使瘤胃發酵底物中的粗蛋白質含量隨之增加，進而誘導擬桿菌門豐度上升， 但當粗飼料全部為雜交構樹青貯時（BPS 組），擬桿菌門的相對豐度顯著降低，這可能是由于隨著構樹比例提高，飼料中單寧等抗營養因子濃度持續增加， 抗營養成分過多會抑制擬桿菌門的增殖或活性 （Abdullah 等，2018）。 本研究中，雜交構樹青貯替代基礎飼糧中的青貯玉米對瘤胃液中厚壁菌門的豐度無顯著影響， 說明飼喂雜交構樹青貯未改變瘤胃對植物纖維的降解能力，這一結果與日糧中ADF 和NDF 含量隨雜交構樹青貯比例的增加變化幅度較小相一致。 疣微菌門的一些細菌在動物的胃腸道消化屏障作用、代謝炎癥和免疫耐受方面起重要作用（韓偉等，2019； 李美鋒等，2017；De Vos 等，2011），其在腸道的定植可減緩脂肪沉積 （Axling 等，2012），此外， 疣微菌門的一些成員還具有多糖水解酶活性（孫佳麗等，2020）。 本研究中疣微菌門的相對豐度位居第三， 與前人多個研究結果不同 （陳鳳梅等 ，2020；Dias 等 ，2018；Chaucheyras-Durand 等 ，2014），推測其在提高務川白山羊的免疫力和減少機體脂肪沉積方面有積極影響， 但究其原因是否與飼喂雜交構樹青貯有關尚需進一步研究。

從屬水平上來看，普雷沃菌屬是反芻動物瘤胃中數量最多的一類擬桿菌門普雷沃氏菌科有益微生物菌屬，主要參與蛋白質、淀粉及木聚糖和果膠的降解（金鹿等，2021），在碳水化合物的代謝中起關鍵作用 （孫佳麗等，2020）。 Pitta 等（2014）研究發現，普雷沃菌屬的相對豐度與日糧中NDF 水平呈負相關關系。 本試驗中， 日糧的NDF 水平隨雜交構樹青貯比例增加而提高，但普雷沃式菌屬的相對豐度呈現先升高后降低的趨勢，與前述擬桿菌門相對豐度的變化一致，說明雜交構樹青貯主要通過影響普雷沃式菌屬的數量改變擬桿菌門的相對豐度，推測普雷沃菌屬的相對豐度受NDF 水平和單寧等抗營養因子的共同作用。未分類的毛螺菌科是瘤胃中的一類半纖維降解菌，普宣宣等（2020）研究發現，卡拉庫爾羊瘤胃中未分類的毛螺菌科相對豐度隨日糧NFC 水平的增高呈先升高后下降的趨勢，這與本研究結果不同。本試驗中添加雜交構樹青貯降低了務川白山羊瘤胃未分類毛螺菌科的相對豐度，可能是由于粉碎后雜交構樹較為粗硬的樹枝部分在采食時更容易被剩下，使肉羊實際攝入的半纖維素和木質素水平較青貯玉米更低，從而誘導未分類的毛螺菌科數量減少，但本試驗中日糧的NFC 水平是否與未分類毛螺菌科相對豐度的變化有關有待進一步研究。

4 結論

高比例雜交構樹青貯顯著提高了務川白山羊瘤胃微生物的豐富度；在門和屬兩個水平上，日糧中添加雜交構樹青貯導致與蛋白質、 淀粉和非纖維植物多糖降解有關的擬桿菌門和普雷沃菌屬有升高趨勢， 以替代50%青貯玉米時相對豐度最高， 雜交構樹青貯替代100%青貯玉米時則抑制相關菌群的增殖； 添加雜交構樹青貯未對纖維降解菌的數量造成不良影響。