頂空固相微萃取結合氣質聯用方法快速測定地椒揮發性成分

李啟東，趙金，孔娜，黃璐瑤，潘少斌*

(1.山東中醫藥大學 藥學院 山東省高校中藥質量控制與全產業鏈建設協同創新中心，山東 濟南 250355； 2. 山東藍城分析測試有限公司，山東 濟南250102)

展毛地椒Thymusquinquecostatusvar. przewalskii(Kom.) Ronn. 是百里香屬的重要植物之一,廣泛分布于山東境內山地丘陵地區[1]。作為藥食兩用的天然植物，具有較高的開發潛力與市場價值。展毛地椒(又名興凱百里香)或百里香ThymusmongolicusRonn.的干燥地上部分， 為中藥地椒[2-3],收載于1977年版《中國藥典》[4]和《中國植物志》[5]，在中醫古籍中常被作為主藥使用。中藥地椒別名地花椒、山椒、山胡椒，《本草綱目》即記載：“地椒出北地，即蔓椒之小者。貼地生葉，形小，味微辛”[6]，其性溫，有小毒，具有祛風解表、行氣止痛、溫中健脾等功效，可用于治療胃痛、關節腫痛、腹痛、氣管炎、感冒、肌膚瘙癢等疾病[7]。此外，地椒作為歷史悠久的天然香料，還是日化用品和食用香精的重要原料[8]。1977年版《中國藥典》[4]中對地椒質量標準僅包括“來源、性狀、顯微鑒別、炮制、性味與歸經、功能與主治、用法與用量、貯藏”項目，2020年常小強[6]參照2015年版《中國藥典》相關方法，制訂了地椒(興凱百里香)質量標準草案。然而，目前針對地椒化學成分的研究仍相對較少。

百里香屬植物氣味芳香，現代研究表明，該屬含有揮發油、黃酮類、聯苯類、萜類甾體類、有機酸類等成分，揮發油是該屬中的重要成分之一，是發揮藥理作用的主要物質基礎。由于產地不同，其揮發性成分的含量和組成差異較大[9]。目前對地椒揮發油的研究主要采用水蒸氣蒸餾提取，再結合氣相色譜-質譜聯用法(gas chromatography-mass spectrometry , GC-MS)進行分析[10]。但水蒸氣蒸餾法僅適用于難溶或不溶于水的成分提取，且存在提取率及提取純度較低等問題。頂空固相微萃取技術(headspace-solid phase microextraction，HS-SPME)是一種新型的樣品預處理方法[11]，具有簡單、快速、靈敏度高、選擇性好的優點，且萃取過程中無需加入有機溶劑，可更加準確地分析待研究樣本中的揮發性成分[12]。本實驗選用山東省臨沂市莒南縣所產展毛地椒，首次利用HS-SPME快速提取地椒地上部分揮發性成分，結合GC-MS分析，共鑒定出56種化學成分，為地椒藥材的質量控制和進一步開發利用提供了參考依據。

1 儀器與材料

1.1 藥材

地椒采自山東省臨沂市莒南縣，經山東中醫藥大學李佳教授鑒定為唇形科植物展毛地椒Thymusquinquecostatusvar. przewalskii (Kom.) Ronn.的地上全草，陰干后待用。

1.2 儀器與耗材

GC1310-TSQ8000 EVO氣相色譜-三重四級桿串聯質譜聯用儀(美國Thermo Fisher公司)；手動固相微萃取裝置(美國Supelco公司)，固相微萃取纖維萃取頭類型為：50/30 μm聚二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/ CAR/ PDMS)；20 mL具聚四氟乙烯膠墊瓶蓋頂空樣品瓶(美國Agilent公司)；HH-6數顯恒溫水浴鍋(常州市金壇友聯儀器研究所)；JY2002型電子分析天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；高純氦氣(純度≥99.999%，濟南堯天儀器有限公司)；NIST 2014數據庫(美國國家標準與技術研究院)。

1.3 方法

1.3.1 頂空固相微萃取

將固相微萃取的50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭置于氣相色譜-三重四級桿串聯質譜聯用儀的進樣口中，于260 ℃下老化10 min。稱取3.0 g粉碎后的地椒樣品，置于20 mL頂空樣品瓶中，密封。于70 ℃恒溫水浴中頂空萃取60 min，隨后從樣品瓶中拔出萃取頭，拭去纖維萃取頭金屬保護套管上殘留水分，立即插入氣相色譜-三重四級桿串聯質譜聯用儀進樣口，于260 ℃解吸3 min，進樣分析。

1.3.2 儀器條件

1.3.2.1 氣相色譜條件

進樣方式：手動進樣；進樣口溫度260 ℃；進樣模式：不分流進樣；隔墊吹掃：5 mL/min；色譜柱：DB-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持3 min，以10 ℃/min 升溫至90 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min 升溫至120 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升溫至130 ℃，保持1 min，以5 ℃/min 升溫至165 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升溫至200 ℃，以10 ℃/min 升溫至220 ℃，再以20 ℃/min 升溫至280 ℃，保持5 min，總運行時間為57 min；載氣：高純氦氣(≥99.999%)，流速：1.0 mL/min。

1.3.2.2 質譜分析條件

離子源類型：EI 源；電子能量：70 eV；接口溫度：280 ℃；離子源溫度：280 ℃；發射電流：50 μA；掃描方式：全掃描；質量掃描范圍：29～400 aum；溶劑延遲：0 min。

2 結果

取地椒的地上部分經HS-SPME提取后，進行GC-MS分析，將所得質譜圖與NIST 2014質譜數據庫檢索的標準圖譜比對，進行定性分析，同時在完全相同的條件下，將正構烷烴樣品進行色譜分析，測定各正構烷烴的保留時間，再根據公式(1)線性升溫保留指數計算公式算出各組分的Kovats保留指數。

RITP=100n+100[tR(x)-tR(n)]/[tR(n+1)-tR(n)]，

(1)

式中，RITP為Kovats保留指數；tR為被測組分的保留時間，下標x為被測組分符號，下標n和(n+1)為分別具有n和(n+1)個碳原子的正構烷烴符號。

根據氣相色譜-質譜總離子流圖(圖1)，圖中數值指RT(保留時間)，采用峰面積歸一化法進行定量分析，測定其相對含量，共分離鑒定出56個化合物(見OSID)，主要結果見表1。

圖1 地椒地上部分頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of the aerial part of Mongolian thyme herb obtained using HS-SPME-GC-MS

氣相色譜-質譜總離子流圖顯示，經過HS-SPME提取、GC-MS分析，所得成分主要以酚醇類、萜類、烯類、酯類、醛酮類為主，其中相對含量較多的是芳樟醇(27.8%)、龍腦(9.12%)、樟腦萜(8.12%)、檸檬烯(7.81%)、3-蒈烯(5.36%)。

峰號保留時間/min保留指數RI化合物名稱英文名稱分子式分子量面積歸一化含量/%18.099653-蒈烯3-careneC10H16136.235.3628.39979樟腦萜campheneC10H16136.238.1238.971005β-蒎烯β-pineneC10H16136.232.5449.261017左旋-β-蒎烯(1S)-(-)-β-PineneC10H16136.232.82710.221058檸檬烯cineneC10H16136.237.81810.631075羅勒烯ocimeneC10H16136.233.34910.91087γ-松油烯γ-terpineneC10H16136.231.691112.081134芳樟醇linaloolC10H18O154.2527.81514.011210龍腦borneolC10H18O154.259.121614.171215松油烯-4-醇terpinene-4-olC10H18O154.252.762516.041284乙酸芳樟酯linalyl acetateC12H20O2196.291.913220.431420β-波旁烯β-cyclobutaC15H24204.351.863421.621456β-石竹烯β-caryophylleneC15H24204.353.524123.61519大根香葉烯 Dgermacrene DC15H24204.353.354224.021533二環大根香葉烯dicyclic macrogeranieneC15H24204.351.564324.31543金合歡烯farneseneC15H24204.352.61

3 討論

常見的揮發油提取方法有水蒸餾法、溶劑提取法、吸收法、壓榨法，最常用的是水蒸氣蒸餾法。水蒸氣蒸餾法提取揮發油成分效率低，且在高溫情況下有些揮發油會發生分解[13]。本實驗首次將HS-SPME運用到地椒揮發油成分的定性和定量分析中，HS-SPME具有采樣、萃取、富集、脫附、進樣的功能，裝置操作簡單且可精確分析地椒中的揮發性成分[14]，節約時間、準確性高、安全性強[15]，已廣泛應用于食品、醫藥、生化等領域[16-17]。

地椒中含有多種不同的化學成分，如揮發油、黃酮類、甾體類、有機酸類和萜類等[7,18]，但目前研究最為廣泛的為地椒揮發油。本實驗通過GC-MS結合保留指數方法，鑒定出地椒揮發油中56種揮發性成分。所得成分主要以酚醇類、萜類、烯類、酯類、醛酮類為主，其中相對含量較多的分別是芳樟醇(27.8%)、龍腦(9.12%)、樟腦萜(8.12%)、檸檬烯(7.81%)和3-蒈烯(5.36%)等。現代藥理研究表明，地椒揮發油具有抗菌、抗腫瘤、抗血栓、抗氧化等活性[19]。

芳樟醇目前除廣泛應用于洗化用品、食用香精外，還具有明顯的鎮靜鎮痛、抗焦慮、催眠、抗菌消炎、抗腫瘤的藥理活性。Huo等[20]研究發現，芳樟醇無論在體內外，均能有效抑制脂多糖(LPS)誘導的促炎癥因子TNF-α和白介素-6(IL-6)的表達，起到抗炎作用，并發現阻斷核因子 NFκB 和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路可能是其發揮抗炎作用的機制。此外，張婷等[21]研究發現芳樟醇通過上調 p53、p21、p27、p57 等DNA 損傷相關基因的表達，能明顯抑制多種人淋巴細胞白血病細胞增殖，而對正常骨髓造血細胞及外周血細胞的增殖沒有顯著影響，因此推斷其具有一定的抗腫瘤作用。桉樹腦類成分作為單萜類化合物，是植物精油的重要組成部分。現代研究表明，單萜類化合物特別是1,8-桉樹腦及其衍生物具有抑菌活性和殺菌能力。通過對1,8-桉樹腦合成衍生物進行體外抑菌實驗發現，其對白色念珠菌和金黃葡萄球菌具有明顯的抑制效果[22-23]。而單萜類和倍半萜類例如桉樹腦和莰酮等對家蠅和蟑螂具有強的驅避活性，這與民間用藥經驗基本相符[24]。

地椒作為多種復方藥物制劑的重要組成部分，具有較好的市場前景和開發價值。地椒揮發油具有含量高、品質優、無殘留、耐抗藥性等特點，而且在醫藥、精細化工及日常生活中應用廣泛，長久以來被視為天然植物精油中的極品[25]。隨著人們對天然香料需求量的增加，地椒常用作肉類除膻劑，廣泛用于食品生產，其含有的鄰傘花烴、香荊芥酚及石竹烯等均可用于調配香料香精，具有廣闊的使用前景[26]。本實驗為地椒揮發油的提取提供了新的思路，也為地椒的綜合開發利用提供了科學依據。