基于網絡藥理學的扶正調理液作用機制及其對S180荷瘤小鼠的影響

曹銘晨，彭小菊*， 黃先菊，柯才華 ，汪川，辛兆洋，于振英，潘冬琦，崔萌納

(1.青島大學附屬醫院，山東 青島266000；2.中南民族大學，湖北 武漢 430074)

惡性腫瘤已成為當前嚴重威脅人類健康的主要疾病，我國的腫瘤發病率呈逐年上升趨勢[1]。目前臨床腫瘤治療的主要手段包括手術治療、放療和化療，患者放、化療后極易出現食欲下降、免疫功能減退、骨髓抑制等一系列不良反應，進而誘發焦慮、抑郁等負面心理狀態，降低生存質量[1-3]。中藥治療惡性腫瘤既古老又年輕，已成為當前腫瘤治療的重要方法之一。基于數據挖掘技術提出的治療惡性腫瘤中藥復方主要包括扶正固本類、清熱解毒類、活血化瘀類、軟堅散結類、化痰利濕類等[1]，但大多以攻伐為主，雖然也有扶正兼以攻伐，也需隨證配伍活血化瘀、理氣、軟堅散結、清熱解毒、瀉下攻積等峻猛之藥[4]，若辯證準確，應用這些復方也能獲得較好的臨床療效。而扶正調理液有別于其他抗腫瘤中藥復方的主要特點是不用虎狼猛藥，但調和氣血陰陽、臟腑功能，調整機體平衡。該配方源于青島市科技局立項課題中“增齡I 號”[5]，由靈芝、黃芪、炒白術、茯苓、生地黃、黃精、制何首烏、玉竹、枸杞、淫羊藿、炒萊菔子、生蒲黃、木香、蒲公英、三七組成。方中以靈芝、黃芪共為君藥，補氣健脾寧心；炒白術、茯苓、生地黃、黃精、制何首烏、玉竹、枸杞、淫羊藿共為臣藥，補益氣血陰陽、五臟六腑；佐以三七、蒲黃、木香、萊菔子活血理氣、通達血脈及胃腸；最后在諸多補益之藥中配伍清熱解毒、利尿行水的蒲公英，使氣機條達、經血通暢、二便得利、毒邪可祛，諸藥共奏扶正補虛、理氣活血、解郁祛邪、調理陰陽之功。本方經彭小菊主任大量臨床應用于亞健康人群和惡性腫瘤病人，目前已獲國家發明專利[6]。臨床觀察發現，扶正調理液能夠顯著改善中老年冠心病患者心絞痛癥狀,降低膽固醇、三酰甘油、SOD(超氧化物歧化物)和MDA(丙二醛)值，有較好的降脂、抗衰老、抗氧化作用[5]。扶正調理液通過提高腫瘤及亞健康患者的睡眠質量、減輕疲勞，改善焦慮、抑郁等負面心理狀態[2]，達到升高腫瘤化療患者的白細胞總數及中性粒細胞數量[3]，提高機體免疫功能，減輕放、化療不良反應以提高耐受性和依從性的目的，改善惡性腫瘤患者的生活質量。近年來運用網絡藥理學的方法探討單味或復方中藥抗腫瘤作用機理的研究較多[7-9]，但通過運用中藥復方改善腫瘤患者體質，或降低西醫治療的不良反應來提高腫瘤患者生存質量的分子作用機制證據尚顯不足。 本文基于網絡藥理學方法初步預測扶正調理液的分子作用機制，通過S180荷瘤小鼠模型驗證扶正調理液對腫瘤生長及免疫器官的影響，以期為臨床應用提供科學的理論依據。

1 研究工具、儀器與材料

1.1 研究工具

基于BATMAN-TCM在線分析平臺(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[10]獲取扶正調理液活性成分并預測可能的相互關系靶點的基因信息；應用Cytoscape 3.5.1軟件[11]構建化合物-疾病-靶點相互作用網絡；基于DAVID數據庫(The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)(https://david.ncifcrf.gov/)[12]、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)(https://www.kegg.jp/)[13]、STRING數據庫(https://www.string-db.org/)[14]、生物分子通路數據庫(Reactome)(http://www.reactome.org)[15]、R語言包3.5.1(R version 3.5.1)[16]進行通路富集分析。

1.2 儀器與材料

1.2.1 實驗動物及瘤株

昆明種雄性小鼠，體質量18～22 g，由湖北省疾病預防控制中心提供；S180腹水瘤細胞購自中國上海典型培養物保藏中心，動物實驗經醫學實驗動物管理委員會批準。

1.2.2 實驗儀器

SW-CJ-2F超凈臺(蘇州凈化設備有限公司),MLS-3781L高壓滅菌鍋(日本三洋公司),Mettlerae240十萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司),Thermo 21R離心機(美國Thermo公司),Advantage A5超凈純水器(美國密理博公司),DW-86L388A超低溫冰箱(中國海爾公司)。

1.2.3 實驗藥物

順鉑粉針劑(規格：10 mg/瓶，批號：041115，齊魯制藥有限公司)；扶正調理液飲片購于青島大學附屬醫院藥劑科，經煎煮后濃縮至藥材質量濃度0.5 g/mL。每次給藥前現取混勻后使用，藥物儲存在4 ℃條件下。

2 方法與結果

2.1 基于BATMAN-TCM構建扶正調理液靶點的作用網絡

BATMAN-TCM是一款中藥成分分子機制的生物信息學分析工具，采用基于相似度的目標靶點預測方法，根據潛在的藥物-靶標相互作用與已知藥物-靶標相互作用的相似性排序[10]，模型預測性能可信度較高。預測相關參數設置Select input type：Herb or Herb list；Herb or Herb list (Pinyin/Latin/English name one herb per line)：LING ZHI, HUANG QI,CHAO BAI ZHU,FU LING,SHENG DI HUAG,HUANG JING,ZHI HE SHOU WU,YU ZHU,GOU QI,YIN YANG HUO,LAI FU ZI,PU HUANG,MU XIANG,PU GONG YING,SAN QI；Input parameter Score cutoff：20；P-value after Benjamini-Hochberg multiple testing correction (AdjustedP-value)：0.05。預測扶正調理液活性成分相關的target name、gene、fit score等參數，篩選BATMAN-TCM相似度評分>48的關鍵靶點共400個，涉及活性化合物358個。根據已知和預測的候選目標蛋白，選擇靶點連接數>12，繪制包含相關生物途徑和TTD(治療靶點數據庫)疾病表型的化合物-靶點-通路-疾病作用網絡圖(圖1，P<0.05)，BATMAN-TCM在線分析提示該相互作用網絡中關鍵靶點包括雌激素受體1(ESR1)、κ型阿片受體(OPRK1)、糖皮質激素受體 (NR3C1)、鹽皮質激素受體(NR3C2)、腺苷A1 受體 (ADORA1) 等，涉及的關鍵疾病包括癌癥(非特異性)、疼痛、乳腺癌、心血管疾病、炎癥反應、前列腺癌、高血壓、類風濕關節炎、阿爾茨海默氏病、抑郁、動脈粥樣硬化等，體現中醫藥整體觀念及中藥組方配伍的多成分-多靶點-多通路調控疾病的作用特點。

圖1 扶正調理液多成分-多靶點-多通路調控疾病的網絡Fig.1 Multi component-multi target-multi pathway regulation network of Fuzheng Tiaoli Decoction

2.2 構建關鍵靶點的蛋白質-蛋白質相互作用網絡

STRING數據庫基于目前已知和預測的蛋白質之間直接、間接相互作用信息，通過計算每個蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)程度的P值，P值高則PPI的置信度高。上傳BATMAN-TCM平臺相似度評分>48的400個扶正調理液關鍵靶點基因ID至STRING在線數據庫，獲取PPI信息，選取P>0.95的置信度的蛋白關系，構建扶正調理液關鍵靶點蛋白在系統水平上的PPI網絡(圖2)。

圖2 扶正調理液靶點PPI網絡Fig.2 The PPI network of key targets of Fuzheng Tiaoli Decoction

網絡拓撲學分析結果顯示，該網絡的平均介數=0.318，平均度值=1.62，PPI富集P< 1.0×10-16。基于INTERPRO Protein Domains and Features(https://www.ebi.ac.uk/interpro/)、SMART Protein Domains(http://smart.embl-heidelberg.de/)、PFAM Protein Domains(http://pfam.xfam.org/)數據庫對PPI網絡靶點進行生物學聚類分析，根據錯誤發現率(false discovery rate)提示關鍵靶點主要涉及神經遞質門控離子通道、離子轉運蛋白、3′5′-環核苷酸磷酸二酯酶、蛇形7TM GPCR化學受體、具有保守的“ HD”基序的金屬依賴性磷酸水解酶、連接的離子通道L-谷氨酸和甘氨酸結合位點、脯氨酰4-羥化酶α亞基同源物等。

2.3 GO富集分析

基于DAVID V6.8數據庫，采用改進的Fisher精確檢驗算法進行基因本體(gene ontology, GO)富集分析，探索扶正調理液靶點基因在基因功能中的作用，應用R軟件根據P值(P<0.005)繪制GO富集分析結果點狀圖(圖3)，其中細胞成分包括細胞質、細胞溶質、細胞質膜、線粒體等；分子功能包括氧化還原酶活性、跨膜轉運蛋白活性、裂解酶活性、酶結合等；生物過程包括小分子代謝過程、細胞氨基酸代謝過程、細胞間信號、穩態過程、脂質代謝過程等。

圖3 GO通路富集分析點狀圖Fig.3 The scatter chart of GO pathway enrichment analysis

2.4 Reactome生化反應通路富集分析

Reactome是基于PSIQUIC Web服務將來自反應組功能相互作用網絡和外部相互作用的生物信息學數據庫(如IntAct(https://www.ebi.ac.uk/intact/)，BioGRID(https://thebiogrid.org/)，ChEMBL(https://www.ebi.ac.uk/chembl/)，iRefIndex(http://irefindex.uio.no/)，MINT(https://mint.bio.uniroma2.it/)和STRING)的分子相互作用數據對數據集進行富集分析，結果偏重于生化反應通路信息。根據錯誤發現率由低至高繪制Reactome途徑-基因圈圖(圖4)，結果提示扶正調理液主要涉及神經元系統、跨化學突觸的傳遞、神經遞質受體和突觸后信號傳遞、代謝、胺配體-結合受體、心臟傳導、G蛋白偶聯受體(GPCR)下游信號、通過GPCR發出信號等通路。

圖4 Reactome生化反應通路富集分析結果Fig.4 Reactome biochemical reaction pathway enrichment analysis results

2.5 KEGG 通路富集分析

應用DAVID V6.8數據庫對扶正調理液靶點進行KEGG生物通路富集分析，靶點基因列表導入DAVID數據庫，勾選OFFICIAL_GENE_SYMBOL、Gene list、Submit list，選擇基因功能分類工具，修改背景為人類，選擇Pathway，篩選P<0.01的通路為可靠通路進行注釋分析。應用R語言根據P值(P<0.05)對主要代謝通路繪圖分析(圖5)。結果主要涉及神經活動配體-受體相互作用，精氨酸和脯氨酸代謝，鈣信號通路，血清素能突觸，嘌呤代謝，味覺轉導，酪氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，氨酰基-TRNA的生物合成，CGMP-PKG信號通路，多巴胺能突觸，GABA能突觸，膽堿能突觸，氨基酸生物合成，碳代謝，唾液分泌，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，胃酸分泌，TRP通道的炎癥介質調節，類固醇激素的合成，長期抑郁等途徑。

圖5 KEGG通路富集分析點狀圖Fig.5 The scatter chart of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 扶正調理液對S180荷瘤小鼠飲食、腫瘤生長及免疫器官的影響

小鼠給藥30 d后停止給藥，稱取體質量。在末次給藥24 h后，將小鼠頸椎脫臼處死，迅速解剖剝取瘤塊、脾臟和胸腺并剝離被膜，分別記錄各臟器質量，計算臟器指數。抑瘤率、脾臟指數、胸腺指數按下式計算：

抑瘤率=(模型組平均瘤質量-給藥組平均瘤質量)/模型組平均瘤質量×100%

脾臟指數=脾臟質量(g)/小鼠體質量(g)

胸腺指數=胸腺質量(g)/小鼠體質量(g)

所有樣本重復測定3次，數據分析應用統計分析軟件SPSS 19.0，數據以平均值±標準差(X±SD)表示，多組間計量資料比較采用 One-way ANOVA單因素方差分析，P<0.05 為存在顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

2.6.1 扶正調理液對小鼠進食量和體質量的影響

結果顯示扶正調理液低、高劑量組小鼠的精神狀態和被毛的光澤度優于陽性組及陰性組。結果如圖6～7所示。低、高劑量組小鼠的單位質量進食量顯著高于陽性組及陰性組(P<0.05)；陰性組、陽性組和低劑量組的28 d體質量增長率分別為20.13%、12.12%和13.84%、而高劑量組小鼠的28 d體質量增長率為28.52%，顯著高于其他各組(P<0.05)。

圖6 小鼠單位質量進食量變化趨勢Fig. 6 Graph showing the changing trends in food intake per unit mass of mice

圖7 扶正調理液對小鼠體質量增長率的影響Fig.7 The effect of Fuzheng Tiaoli decoction on the growth rate of mice body mass

2.6.2 小鼠腫瘤質量及腫瘤抑制率比較

結果如圖8所示，陰性組平均瘤質量(1.65±0.24)g(圖中抑瘤率根據陰性組腫瘤質量計算)；陽性組平均瘤質量(0.86±0.11)g，腫瘤抑制率47.89%；扶正調理液低劑量組平均質量(1.51±0.27)g，腫瘤抑制率僅為8.73%；而高劑量組平均瘤質量(1.33±0.16)g，腫瘤抑制率19.54%，各組間比較存在顯著性差異(P<0.01)。

圖8 S180荷瘤小鼠腫瘤抑制率Fig.8 Tumor inhibition ratein S180 tumor-bearing mice

2.6.3 小鼠臟器指數的比較

結果如圖9所示，陰性組、陽性組、扶正調理液低劑量組和高劑量組的胸腺指數分別為0.003 24±0.000 23、0.003 67±0.000 31、0.003 47±0.000 26和0.003 43±0.000 31，低劑量組和高劑量組的胸腺指數不存在顯著性差異(P>0.05)，低于陽性組但顯著高于陰性組(P<0.05)，提示扶正調理液可以顯著增加S180荷瘤小鼠的胸腺質量，改善胸腺萎縮程度。脾臟指數分別為0.079 3±0.008 4、0.079 8±0.007 1、0.070 3±0.006 5和0.058 3±0.051 9，陰性組和陽性組脾臟指數不存在顯著性差異(P>0.05)，高劑量組顯著低于陽性組(P<0.01)，提示扶正調理液可以顯著改善S180荷瘤小鼠的脾臟腫大的狀態。

注：*P<0.05， **P<0.01，與陰性組相比。圖9 扶正調理液對S180荷瘤小鼠胸腺指數、脾臟指數的影響Fig. 9 The effect of Fuzheng Tiaoli Decoction on thymus and spleen indices of S180 tumor-bearing mice

3 討論與結論

惡性腫瘤患者普遍存在較高程度的營養不良問題，營養風險會對腫瘤預后及臨床結局產生一定的負面影響[17]；同時，這些患者普遍有焦慮、失眠、郁悶、煩躁等不良情緒。臨床應用扶正調理液時發現其顯著改善腫瘤及亞健康患者的睡眠質量，減輕疲勞，改善焦慮、抑郁等負面心理狀態[3]，顯著升高惡性腫瘤化療患者的白細胞總數及中性粒細胞數量[4]。 經本文研究，Reactome富集分析結果提示扶正調理液主要涉及神經元系統、跨化學突觸的傳遞、神經遞質受體和突觸后信號傳遞、代謝、GPCR信號通路等。KEGG通路富集分析結果涉及更為豐富的生物學通路，與Reactome富集分析結果有異曲同工之妙，相關通路也主要與神經系統和代謝途徑相關：如與精神狀態相關通路包括神經活動配體-受體相互作用、鈣信號通路、GABA能突觸、膽堿能突觸、多巴胺能突觸、長期抑郁等，其中大多數通路屬于GPCR相關通路；與進食相關的通路包括血清素能突觸、味覺轉導、唾液分泌、胃酸分泌等；與營養代謝相關的通路包括各類氨基酸和生物合成及代謝過程、氨酰基-TRNA的生物合成、碳代謝、嘌呤代謝等。

扶正調理液顯著增加了S180荷瘤小鼠的單位質量進食量和營養狀況，高劑量組小鼠的精神狀態和被毛光澤度優于陽性組及陰性組，高劑量組28 d體質量增長率為28.52%，顯著高于其他組(P<0.05)。臨床觀察和動物實驗研究結果均顯示，扶正調理液具有改善焦慮、抑郁等負面心理狀態和改善睡眠質量等作用，這可能與關鍵靶點OPRK1、NR3C1、NR3C2、ADORA1密切相關。KEGG、Reactome通路富集分析結果提示扶正調理液相關通路與神經系統密切相關，關鍵靶點如OPRK1、NR3C1、NR3C2主要涉及強啡肽能系統和皮質醇系統。強啡肽能系統參與神經性疼痛的傳遞，強啡肽根據其阿片樣物質或非阿片樣物質的作用發揮抗傷害感受的作用，通過腦皮質回路影響疼痛的負性情感[18]。OPRK1及其內源性配體強啡肽可介導行為對厭惡或壓力性經歷的反應[19]，接觸應激通過增加邊緣區域的強啡肽水平[20]，激活OPRK1引起嚙齒動物煩躁不安和抑郁樣行為[21-22]。近年來研究發現皮質醇對壓力的影響可能取決于與壓力途徑相關基因的表達水平，其中主要涉及NR3C1、NR3C2基因表達與精神狀態和精神壓力轉化相關疾病密切相關，涉及了精神分裂癥、抑郁癥、狂躁癥、精神障礙等多種神經系統疾病[23-25]，提示扶正調理液影響皮質醇系統相關基因的表達可能是其發揮改善精神系統癥狀的重要途徑之一。此外，NR3C1、NR3C2也與多種腫瘤的進展密切相關，如NR3C1與前列腺癌、結直腸癌、大腸癌等的進展密切相關[26-28]，NR3C2的表達介導膠質母細胞瘤、口腔鱗狀細胞癌、結直腸癌等惡性腫瘤的進展[29-31]。

GO富集分析結果提示細胞成分方面涉及細胞質、細胞溶質、細胞質膜、線粒體等生物途徑。腫瘤的發生和轉移與腫瘤所處的微環境密切相關，腫瘤微環境不僅包括癌細胞本身，還包括周圍的基質細胞、免疫細胞、內皮細胞、生長因子以及特殊的生理生化條件，腫瘤微環境與腫瘤細胞相互作用共同介導了腫瘤的免疫耐受[32]。腺苷受體在腫瘤的免疫耐受過程中起到了非常重要的作用，腺苷受體通過P1型嘌呤受體(ADOA1R、ADOA2AR、ADOA2BR、ADOA3R)介導抗炎癥效應[33]。腺苷受體也屬于G蛋白偶聯受體家族，廣泛表達于包括免疫細胞在內的多種細胞。腺苷受體通過其受體抑制NK細胞、DC細胞、CTL等功能的發揮，同時增強免疫抑制細胞的活性，參與腫瘤微環境免疫耐受的形成[32]。腺苷受體作用于血管內皮細胞及基質細胞，促進腫瘤微環境新生血管的形成，為腫瘤的轉移提供必要條件，使其成為抗腫瘤藥物研究的重要靶點之一[32]。已有研究表明，ADORA1抑制介導腫瘤的免疫逃逸進程[32-33]，此外還有研究指出ADOR1的表達也參與了抗抑郁樣作用[34-35]，提示扶正調理液通過影響ADOR1的表達改善腫瘤患者的精神狀態或影響腫瘤進展，非常值得進一步深入研究。

本研究開展的動物實驗結果顯示，扶正調理液顯著改善S180荷瘤小鼠脾臟腫大和胸腺萎縮的組織病變情況，增強荷瘤小鼠免疫器官功能，增加小鼠進食量、體重和毛發光澤度等，與文中網絡藥理學的研究結果不謀而合。本研究提示扶正調理液可能通過影響OPRK1、NR3C1、NR3C2、ADORA1、ESR1等基因的表達，影響神經活動配體-受體相互作用、鈣信號通路、血清素能突觸、味覺轉導、氨基酸代謝、唾液分泌等信號通路，改善焦慮、抑郁等負面心理狀態，改善睡眠質量、減輕疲勞、改善食欲和營養狀況，增強免疫功能，抑制腫瘤的進展，體現中藥復方的多靶點和整體性的作用特點，為進一步研究扶正調理液分子作用機制提供了新思路。