基于疏肝解郁功效的逍遙散寒苦肝和溫辛肝性效關系研究

師建茹，高耀，趙慧亮，田俊生*，武嫣斐*

(1. 山西醫科大學第一醫院, 山西 太原 030001；2. 山西大學 中醫藥現代研究中心，山西 太原 030006)

抑郁癥是以情緒異常低落為主要臨床表現的精神疾病，嚴重者可能導致自殺，具有發病率、復發率、致殘率高等特點，到2030年將成為全球僅次于缺血性心臟病的第二位疾病負擔源，其危害已引起全世界醫藥衛生界的重視[1-2]。對個人而言，其年患病率為6.6%，而終身患病率高達 16.2%[3]。目前臨床多用西藥治療，但有一定的毒副作用。因此，尋找有效、安全、依從性好的治療方法受到人們的普遍關注。

抑郁癥多歸屬于中醫“郁證”范疇，《醫碥》言“郁而不舒，則皆肝木之病。”由此可見肝與郁證密不可分。陳士鐸《石室秘錄》言 “夫郁者，未有不傷肝者。”為后世醫家從肝論治郁證奠定了理論基礎。葉天士《臨證指南醫案·郁》所載的醫案均屬情志之郁，治則多以舒肝理氣為主。同時有部分學者提出肝主疏泄，對于應激事件所產生的反應起到關鍵的調節作用，這與中醫認為肝失疏泄致抑郁癥發病的觀點不謀而合[4]。

逍遙散源于宋代《太平惠民和劑局方》，由柴胡、當歸、炒白術、茯苓、炙甘草、生姜、白芍、薄荷 8 味藥組成，具有疏肝解郁、養血健脾的功效，是疏肝解郁的經典方之一。實驗研究和臨床應用均表明[5-8]，逍遙散具有確切的治療抑郁癥的作用。柴胡[9]、白芍[10]、當歸[11]、薄荷[12]單味藥也具有抗抑郁的功效。施學麗等[13]采用應用關聯規則、聚類方法等數據挖掘技術分析治療抑郁癥的中藥專利復方組方配伍規律，發現逍遙散為治療抑郁癥的基本方。因此，圍繞逍遙散的藥性與功效的內在聯系研究逍遙散抗抑郁的作用機制具有重要意義。

《神農本草經》序錄云“藥有酸咸甘苦辛五味，又有寒熱溫涼四氣。”四氣，就是寒熱溫涼四種不同的藥性，又稱四性，反映了藥物對人體陰陽盛衰、寒熱變化的作用傾向，為藥性理論重要組成部分。藥性的寒熱溫涼是根據藥物作用于人體產生的不同反應和療效總結出來的，其與所治疾病的性質是相對而言的[14]。王耘等[15]提出藥性組合與功效相結合的研究思路，從藥性角度分析抗衰老中藥并闡釋不同類別的藥性特征。吳東雪等[16]以代表性中藥的活性成分作用靶標及其蛋白質-蛋白質相互作用( protein-protein interaction，PPI)網絡模塊的功能識別為橋梁，銜接藥性和功效，探討活血化瘀藥性效關系。侯寧等[17]進行了基于藥性組合的丹參和紅花的性效關系研究。朱艷玲[18]總結了歸肝經藥物四性規律，歸肝經性寒涼藥物居多，從五味分析，辛味或苦味居多；歸肝經性溫熱藥物，從五味分析，味辛者居多。

因此，本實驗圍繞逍遙散中溫辛肝藥性、寒苦肝藥性進行分析，以逍遙散中柴胡、白芍(寒苦肝藥性、寒苦心藥性)、當歸、薄荷(溫辛肝藥性、溫辛心藥性)為研究載體，通過成分-靶點-蛋白分析，構建藥性組合PPI網絡，說明柴胡、白芍、當歸和薄荷同歸肝經藥性的共性特征和寒苦藥性、溫辛藥性在發揮疏肝解郁功效上的差異，從而闡釋疏肝解郁中藥氣味組合與功效的內在聯系。

1 材料與方法

1.1 研究載體的選取

中藥的性能，是指藥物與療效有關的性質與功能，四氣、五味為中藥的基本藥性。2020年版《中國藥典》[19]中記載柴胡味苦、辛，性微寒，歸肝、膽經，功能疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣；白芍味苦、酸，性微寒，歸肝、脾經，功能養血調經，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽；當歸味甘、辛、苦，性溫，歸肝、心、脾經，功能補血活血，調經止痛，潤腸通便，潤燥滑腸；薄荷味辛，性溫，歸肺、肝經，功能疏散風熱，清利頭目，利咽，透疹，疏肝行氣。肝與郁證密不可分，因此本文對肝經進行深入的研究。本文選擇具有疏肝解郁功效的寒苦肝藥性和溫辛肝藥性作為研究載體，其中寒苦肝藥性選取了柴胡和白芍，溫辛肝藥性選取了當歸和薄荷。

1.2 中藥成分的篩選

以逍遙散中寒苦肝藥性為例，利用TCM database@Taiwan(http://tcm.cmu.edu.tw/)[20]、TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)[21]、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[22]數據庫結合文獻挖掘的方法收集柴胡、白芍的主要化學成分，匯總得到寒苦肝藥性中柴胡和白芍的主要有效成分。同理可獲取溫辛肝組合中藥當歸和薄荷的主要有效成分。

1.3 藥性組合靶點網絡的預測

應用BATMAN-TCM 分析平臺，在線獲取逍遙散中寒苦肝藥性中柴胡和白芍主要有效成分的靶點信息，并選擇其中高可信度的蛋白作為候選靶點(prediction score cutoff >20)。由于檢索到的藥物靶點存在命名不規范等問題，因此，本實驗使用 UniProt 數據庫中 UniProtKB 搜索功能(http://www.uniprot.org/，Update in 2014-04-10)，通過輸入蛋白名稱并限定物種為人，將檢索得到的所有蛋白校正為其官方名稱(official symbol)，經上述數據庫檢索和轉化操作，獲取與活性成分相關的靶點信息。同理可獲取逍遙散中溫辛肝藥性中中藥當歸和薄荷的主要有效成分靶點。

1.4 藥性組合靶點網絡的構建

將靶點信息整合后導入Cytoscape 3.5.1 平臺，應用Advanced Network Merge 插件[23]中的Union計算得到全集網絡，即逍遙散中寒苦肝藥性靶點網絡；同理構建逍遙散中溫辛肝藥性靶點網絡。應用Advanced Network Merge插件中的Intersection和Difference計算對上述2個藥性組合靶點網絡取交、補集，分別得到交集靶點群為2個藥性組合共有靶點集，即逍遙散中歸肝經藥性的作用靶點群，補集部分分別為逍遙散中寒苦藥性的獨特靶點群和溫辛藥性的獨特靶點集。通過對2個藥性組合靶點網絡的交補集進行分析，可以對比解析逍遙散中歸肝經藥性的共性特征和寒苦藥性疏肝解郁藥的特異性特征及溫辛藥性疏肝解郁的特異性特征。

1.5 藥性組合靶點網絡的構建

使用Metascape數據庫[24]對藥性組合蛋白進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG )通路分析，設置閾值P< 0.01，篩選出排名靠前的 KEGG 通路。Metascape 采用一種啟發式算法從得到的簇中選擇信息量最大的術語。KEGG通路P值越小，標記的顏色越深。節點可以通過其群集ID或其P值進行著色。邊緣連接相似的術語越多，相似性越高。分別構建逍遙散中歸肝經藥性靶點網絡、寒苦藥性靶點網絡和溫辛藥性靶點網絡并進行功能分析。對上述功能注釋進行分類和對比，結合文獻及數據庫，研究逍遙散中歸肝經藥性的共性特征及寒苦藥性、溫辛藥性的特異性特征。同時，基于中藥藥性理論，結合文獻中對靶點和模塊的現代藥理學研究，分析逍遙散中疏肝解郁中藥的化學和生物學基礎，闡釋藥性與功效的內在聯系。本文具體技術路線見圖1。

圖1 逍遙散中寒苦肝和溫辛肝性效關系研究技術路線圖Fig.1 Technical roadmap for the nature-effect relationship research of cold bitter and warm pungent medicinal properties of Xiaoyaosan

2 結果

2.1 藥性組合成分和靶點信息

通過 TCM database@Taiwan、TCMID 和BATMAN-TCM 等數據庫及文獻挖掘，篩選高可信度的蛋白作為候選靶點，去除沒有對應靶點的成分。篩選結果：柴胡共 67 個成分，白芍共 18 個成分，當歸共 97 個成分，薄荷共 23 個成分，共獲得 85 個逍遙散中寒苦肝藥性有效成分和 116 個溫辛肝藥性有效成分。作用靶點來源于BATMAN-TCM 分析平臺，去除重復靶點，共獲取逍遙散中寒苦肝藥性作用靶點 1127 個，溫辛肝藥性作用靶點 1389 個，部分靶點信息見表 1。經篩選后 2 個藥性的有效成分個數存在差異，但以相同方法獲取靶點后，2 個藥性組合的靶點數相當，對后續的網絡構建和模塊識別影響較小，故有效成分數量的差異，對最終的分析結果無較大影響。

表1 逍遙散中藥性組合的部分靶點信息Table 1 Partial target information of drug combinations in Xiaoyaosan

2.2 藥性組合PPI網絡的構建

搜索 STRING 數據庫，獲取各靶點相關的PPI信息。以交集逍遙散中苦肝藥性靶點網絡為例，將靶點網絡的PPI信息導入 Cytoscape 3.5.1，取最大連通子圖為歸肝經藥性的PPI網絡。該網絡包含 946 個節點、6748 條邊。同理，構建逍遙散中寒苦藥性靶點的PPI網絡和溫辛藥性靶點的PPI網絡。其中逍遙散中寒苦藥性靶點的PPI網絡包括28個節點、24條邊；溫辛藥性靶點的PPI網絡包含 274 個節點、899 條邊。

2.3 不同組合藥性PPI網絡的功能分析

通過 Metascape 對不同組合藥性PPI網絡進行KEGG功能分析，其中，逍遙散中歸肝經藥性PPI網絡主要通過調節神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、cAMP 信號通路、多巴胺能突觸、血清素能突觸、膽堿能突觸、酪氨酸代謝、味覺傳導、嘌呤代謝、TRP通道的炎性介質調節、MAPK 信號通路、色氨酸代謝、肌萎縮側索硬化、Rap1 信號通路、精氨酸和脯氨酸代謝、甾體激素生物合成等發揮疏肝解郁的功效。如圖 2 所示。

圖2 逍遙散中歸肝經藥性KEGG通路圖Fig.2 KEGG pathway of the liver meridian medicinal property of Xiaoyaosan

逍遙散中寒苦藥性PPI網絡主要通過調節膽汁分泌、MAPK 信號通路、IgA 產生的腸道免疫網絡、催產素信號通路、Hipp 信號通路、HIF-1 信號通路、胰島素抵抗、心肌細胞腎上腺素能信號通路等發揮疏肝解郁的功效，如圖3所示。

圖3 逍遙散中寒苦藥性KEGG 通路圖Fig.3 KEGG pathway of the cold bitter medicinal property of Xiaoyaosan

逍遙散中溫辛藥性PPI網絡主要通過調節神經活性配體-受體相互作用，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，嘧啶代謝，cAMP信號通路，氨基酸生物合成，維生素消化和吸收，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，神經營養因子信號通路，腎素-血管緊張素系統，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，膽堿能突觸，甘油磷脂代謝等發揮疏肝解郁的功效，如圖 4 所示。

圖4 逍遙散中溫辛藥性KEGG 通路圖Fig.4 KEGG pathway of the warm symplectic medicinal property of Xiaoyaosan

從統計分析結果可以看出(表2)，逍遙散中寒苦藥性PPI網絡和溫辛藥性PPI網絡均與維生素轉運、胰島素抵抗有關。溫辛藥性、歸肝經藥性和溫辛藥性PPI網絡均與神經活性配體-受體相互作用、cAMP 信號通路、膽堿能突觸有關。逍遙散中寒苦藥性、歸肝經藥性和溫辛藥性PPI網絡均與 MAPK 信號通路、腎上腺素能信號通路的反應有關。逍遙散中寒苦藥性、溫辛藥性和歸肝經藥性PPI網絡均與行為學有關。逍遙散中疏肝解郁中藥可以通過影響上述信號通路等發揮抗抑郁的作用。因此推測這3個PPI網絡中的中藥可能具有預防和治療抑郁癥的作用。

表2 逍遙散中不同藥性的功能列表Table 2 A list of functions of different medicinal properties of Xiaoyaosan

進一步對逍遙散中寒苦肝藥性和溫辛肝藥性性效關系進行梳理，如圖5所示。逍遙散中寒苦藥性蛋白PPI網絡的通路富集發現，逍遙散中寒苦藥性對應的功能包括能量代謝和炎癥反應；逍遙散中溫辛藥性PPI網絡的通路富集發現，逍遙散中溫辛藥性對應的功能包括神經營養和氨基酸代謝。逍遙散中歸肝經藥性PPI網絡的通路富集發現，逍遙散中歸肝經藥性蛋白對應的功能包括神經遞質、信號通路和內分泌。由此發現，不同藥性網絡對應不同的功能，這些功能可能在逍遙散抗抑郁中發揮重要的作用。

圖5 逍遙散中寒苦肝藥味和溫辛肝藥味性效關系Fig.5 The relationship between the taste of cold and bitter liver medicine and the taste of warm pungent liver medicine of Xiaoyaosan

3 討論

PPI網絡是由各個蛋白質之間的相互作用組成的，這些蛋白參與生命過程的許多方面，例如生物信號傳遞、基因表達的調控、能量代謝等。對生物系統中大量PPI的分析有助于理解疾病發病的復雜機理以及藥物治療疾病的復雜機制。本研究通過數據庫檢索獲取逍遙散中溫辛肝藥性、寒苦肝藥性的主要有效成分及作用靶點，對藥性PPI網絡進行功能注釋和統計分析。該研究從分子網絡水平闡釋了逍遙散中歸肝經藥性的共性特征和寒苦藥性、溫辛藥性的特異性特征。

歸肝經藥物的性效規律與肝臟生理功能、病理特點關系密切。實驗結果表明，逍遙散歸肝經藥性PPI網絡主要通過 HTR2B 等靶點參與神經遞質、信號通路、內分泌發揮疏肝解郁的功效[25]。因此推測出逍遙散歸肝經藥性PPI網絡具有疏肝解郁的功效。

歸肝經藥性寒涼的藥物味苦者最多，性寒味苦者清熱解毒的作用更大，治療熱性和熱毒病證，同時還具有清熱利濕、利水、止痛等的功效。實驗結果表明，逍遙散寒苦藥性網絡通過 CREBRF 等靶點參與能量代謝、炎癥反應發揮疏肝解郁的功效[26-27]，所以可以推測出逍遙散寒苦藥性PPI網絡具有疏肝解郁的功效。

歸肝經藥性溫熱的藥物味辛者最多，最明顯的功效是祛風、除濕、強筋骨、止痛，反映出辛能行能散，還具有活血化瘀、行氣的功效。實驗結果表明，逍遙散中溫辛藥性主要通過 ADCY5等靶點參與神經營養、氨基酸代謝發揮疏肝解郁的功效[28]。所以可以推測出逍遙散中溫性藥性PPI網絡具有疏肝解郁的功效。

雖然，逍遙散中寒苦藥性PPI網絡和溫辛藥性PPI網絡通過不同的靶點共同參與調節細胞對胰島素抵抗等生命過程而發揮作用，但從功能分析結果可以發現兩者是通過不同的靶點發揮作用的。本文通過構建逍遙散中溫苦肝藥性、寒苦肝藥性兩個藥性組合中藥成分的PPI網絡，并基于模塊聚類分析方法對這兩個藥性PPI網絡的交補集進行綜合分析，從分子網絡水平說明了逍遙散中歸肝經藥性的中藥可能具有神經遞質、信號通路、內分泌等疏肝解郁功效。

逍遙散中寒苦藥性PPI網絡通過調節能量代謝、炎癥反應發揮功效。逍遙散中溫辛藥性PPI網絡具有調節神經營養、氨基酸代謝等功效，其中寒苦藥性PPI網絡和溫辛藥性PPI網絡通過不同的靶點共同參與調節細胞對胰島素抵抗等生命過程而發揮作用。“肝郁”是逍遙散應用的基礎，這些重要的生物學功能與藥性的關系用現代科學術語闡明了逍遙散疏肝解郁功效的科學內涵，為逍遙散中的藥性與功效的內在聯系研究提供了新思路和方法。