基于網絡藥理學研究參附注射液治療膿毒癥的作用機制

應天昊, 余濤, 趙佳寧, 孫萌萌, 祝璇, 李曉麗, 唐一迪, 張雷明

(煙臺大學藥學院 分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室，山東 煙臺 264005)

膿毒癥是由潛在或已知感染因素引起的全身炎癥反應綜合征，其發病機制復雜，涉及炎癥反應失衡、神經內分泌網絡異常、免疫功能障礙和多器官衰竭等多個方面[1]。世界衛生組織將膿毒癥確認為全球衛生優先事項，病死率高達30%以上[2-3]。在2019年底爆發的新型冠狀病毒感染中，后期危重患者多并發膿毒癥，進而危及生命[4]。研究表明，中醫藥治療膿毒癥具有獨特優勢，能增加療效、降低不良反應、改善預后等[5]。

雖然傳統中醫理論體系中無“膿毒癥”病名記載，但根據其臨床表現和演變過程，可從《傷寒論》《溫熱論》中發現相似癥狀的記載，故將其歸于“熱病” “溫毒” “厥證” “脫證”等范疇[6]。參附注射液來源于參附方，主要成分為人參和附子，具有回陽救逆和益氣固脫的功效[7]，主治厥脫及陽虛諸證[8]，同時也得到了診療方案《中國膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南》[9]的推薦，被廣泛用于膿毒癥的治療[10-12]。然而，尚不清楚參附注射液是通過哪種作用機制改善膿毒癥，且目前并沒有具體作用機制研究。因此本文通過網絡藥理學和分子對接方法，以參附注射液中的活性成分為研究對象，通過靶點、通路篩選以及體內實驗驗證，探索參附注射液治療膿毒癥的分子機制。

1 材料與方法

1.1 參附注射液活性成分和靶點獲取

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取參附注射液中人參和附子2種中藥的所有成分，按ADME參數[13]即類藥性(drug- likeness,DL)≥0.18、口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%來篩選化合物，共得到34個活性成分。下載Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中活性成分的SDF結構文件，在Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)中檢索靶點，按Probability>0篩選后即得到活性成分作用靶點。通過Uniprot(https://www.uniprot.org/)數據庫轉換得到靶點的Gene Symbol。

1.2 潛在靶點獲取

在Genecards(https://www.genecards.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)和OMIM(https://www.omim.org/)數據庫中檢索關鍵詞“sepsis”，整合后得到膿毒癥相關靶點并與參附注射液活性成分靶點取交集，獲得參附注射液治療膿毒癥的潛在靶點。

1.3 構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡

在STRING(https://string-db.org/)平臺中上傳1.2項中獲得的參附注射液治療膿毒癥的潛在靶點，物種選項為“智人”，下載結果文件導入Cytoscape軟件構建蛋白質-蛋白質相互作用( protein-protein interaction，PPI)網絡，通過內置分析功能分析參數。

1.4 GO分析與KEGG通路分析

提交潛在靶點到Metascape(http://metascape.org/gp/)數據庫，Input as species和Analysis as species都設置為homo sapiens，進行基因本體( gene ontology， GO)分析和基于京都基因與基因組百科全書 ( Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路分析(P<0.05)，探究參附注射液治療膿毒癥的可能作用機制。

1.5 構建參附注射液活性成分-膿毒癥靶點-作用通路網絡

創建成分-靶點-通路的Network和Type文件，導入Cytoscape軟件中，構建網絡圖并分析。

1.6 分子對接

通過Open Babel 2.3.2軟件將所選化合物的SDF結構文件轉化為PDB文件，從 Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb)數據庫中檢索獲得受體蛋白PDBID，采用AutoDockTools軟件對受體蛋白進行修飾，用Grid程序下的Grid Option工具對受體蛋白進行處理，并轉化為pdbqt格式。利用AutoDock Vina 1.1.2對受體蛋白與配體小分子進行分子對接，得到結合能打分，這種親和能是衡量配體是否能與受體分子有效結合的重要指標，能值越低，二者的結合效果越好。

1.7 體內實驗驗證

1.7.1 動物

BALB/c小鼠(8～10周)，雄性，質量18～20 g，購自濟南朋悅動物繁育有限公司，合格證號SCXK(魯)20190003。造模前在煙臺大學SPF級動物房正常飼養，室溫在(22±1)℃，相對濕度為40%～60%，自由飲水攝食。

1.7.2 藥物

參附注射液為華潤三九(雅安)藥業有限公司藥品，10 mL/支，國藥準字Z51020664。

1.7.3 試劑與儀器

脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)(美國Sigma公司，貨號：L2630-25MG)；小鼠TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：SEKM-0034、SEKM-0007)。ERK1/2、p-ERK1/2抗體(上海碧云天生物技術有限公司，貨號：AF1051、AF1891)；GAPDH抗體(美國Proteintech公司，貨號：60004-1-lg)。

高速低溫離心機(德國Eppendorf公司，型號：5424R)；電泳系統(美國Bio-Rad 公司，型號：PowerPacTMHC)；超純水儀 Milli-Q (美國Millipore 公司，型號：IQ7000)；多功能酶標儀(美國MD公司，型號：SpectraMax iD3); ECL凝膠成像儀(美國GE公司，型號：ImageQuant 300/400/RT ECL)。

1.7.4 分組與模型制備

BALB/c小鼠24只，隨機分成3組：空白組、模型組、參附注射液組(20 mL/kg)，每組8只。除空白組外，其他各組于給藥30 min后尾靜脈注射LPS(10 mg/kg)，造成小鼠膿毒癥模型。

1.7.5 給藥方法

參附注射液組(20 mL/kg)腹腔注射給藥預保護30 min，空白組和模型組給予相同體積生理鹽水。

1.7.6 檢測指標與方法

1.7.6.1 炎癥因子檢測

造模后12 h后，在小鼠眼內呲取血，室溫靜置0.5 h，4 °C，3500 r/min離心15 min，離心半徑5 cm，分離血清，采用ELISA法測定血清中TNF-α和IL-6含量。

1.7.6.2 Western blot法驗證靶點表達

1.7.7 統計學方法

2 結果

2.1 參附注射液活性成分和靶點獲取

通過TCMSP和SwissTargetPrediction數據庫收集到參附注射液中的活性成分共34個，其中人參19個，附子15個，共得到682個活性成分靶點。

2.2 潛在靶點獲取

通過GeneCards、OMIM和Drugbank數據庫得到膿毒癥靶點1422個。兩者取交集后獲得參附注射液治療膿毒癥的潛在靶點137個，見圖1。

圖1 參附注射液與膿毒癥靶點維恩圖Fig.1 Venn diagram of the targets of Shenfu Injection and sepsis

2.3 PPI網絡構建與分析

潛在靶點的PPI網絡圖中共有節點137個、邊1956條，見圖2。結果表明，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1，92)、白介素6(IL6，91)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3，85)、腫瘤壞死因子(TNF，84)、血管內皮生長因子A(VEGFA，84)度值(degree)較大，可能是關鍵靶點。

圖2 潛在靶點PPI網絡Fig.2 PPI network of the potential targets

2.4 GO分析和KEGG通路分析

將參附注射液治療膿毒癥的潛在靶點通過GO富集分析，根據P<0.05選擇生物過程、細胞組分和分子功能富集高的前10個進行可視化并生成柱狀圖(圖3)。如圖3所示，生物過程主要涉及趨性、細胞遷移正調控和細胞運動正調控；細胞組分主要涉及膜筏、膜微區和膜區等；分子功能主要涉及蛋白質酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性和以羥基為受體的磷酸轉移酶活性等。

圖3 參附注射液治療膿毒癥靶點的GO富集分析(排名前10)Fig.3 GO enrichment analysis of Shenfu Injection in sepsis treatment (top 10)

通過Metascape數據庫對參附注射液治療膿毒癥的潛在靶點進行 KEGG 通路富集分析(P<0.05)，選取前20條通路，見圖4。如圖所示，這些潛在靶點主要富集在癌癥信號通路、前列腺癌、乙型肝炎、PI3K-Akt信號通路、癌癥中的蛋白聚糖、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、人類巨細胞病毒感染、MAPK信號通路、內分泌抵抗等信號通路。

圖4 參附注射液治療膿毒癥的KEGG通路分析(排名前20)Fig.4 KEGG enrichment analysis of Shenfu Injection in sepsis treatment (Top 20)

2.5 構建參附注射液活性成分-膿毒癥靶點-作用通路網絡

由于潛在靶點較多，所以篩選 PPI網絡圖中度值排名前30的靶點參與成分-靶點-通路網絡構建。如圖5所示，度值較大的成分有人參皂苷-Rh4_qt、戈米辛 B、山奈酚、石防風素、水黃皮次素、去氧穿心蓮內酯、人參皂苷rh2、苯甲酰歐烏頭堿、吉九里香堿等，均與多個靶點連接。度值較大的靶點包括PIK3CA、AKT1、MAPK1、EGFR、MAPK3、MAPK8、PIK3R1、MAPK14、VEGFA等。度值較大的通路涉及了癌癥通路、PI3K-Akt、MAPK、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE、Ras、Rap1和HIF-1等信號通路。

圖5 成分-靶點-通路網絡圖Fig.5 Network of ingredients-targets-pathways

2.6 分子對接

將PPI網絡中度值排名前10位的靶點蛋白，分別與成分-靶點-通路網絡中排名前5的活性成分進行分子對接。由于膿毒癥的疾病特點，所以選取了IL-6、MAPK3、TNF、VEGFA、STAT3與影響炎癥和細胞凋亡有關的靶蛋白，進行分子對接，結果見圖6。結合能越小，表明其結合性越好，其中MAPK3靶點與5種活性成分結合能力較好。結果表明，參附注射液中的活性成分能較好地與膿毒癥相關靶點結合，潛在生物活性高。

圖6 活性成分與PPI網絡排名前5靶點的結合能熱圖Fig.6 Heat map of the compounds in Shenfu Injection radix with top five targets′ sequencing in a protein-protein interaction network

2.7 體內實驗驗證

2.7.1 參附注射液對膿毒癥小鼠炎癥因子表達的影響

與對照組相比，模型組中 TNF-α和IL-6表達顯著升高(P<0.001)。與模型組相比，參附注射液(20 mL/kg)可顯著降低 TNF-α和IL-6表達(P<0.05、P<0.001)，見圖7。

注:與對照組相比，***P<0.001；與模型組相比，△P<0.05，△△△P<0.001。圖7 參附注射液對膿毒癥小鼠血清中TNF-α和IL-6表達水平的影響Fig.7 Effects of Shenfu Injection on the expression levels of TNF-α and IL-6 in the serum of septic mice n=3)

2.7.2 參附注射液對膿毒癥小鼠肝組織ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達的影響

MAPK3是MAPK信號轉導途徑的重要組成部分，調控著ERK蛋白的表達，并且在構建的成分-靶點-通路網絡中度值較大且與活性成分結合能力較好。所以，本實驗通過檢測參附注射液對膿毒癥小鼠中非磷酸化ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達的影響，對預測靶點進行驗證(圖8)。結果顯示，與模型組相比，參附注射液治療能顯著提高非磷酸化ERK1/2蛋白的表達(P<0.01)，降低p-ERK1/2蛋白的表達(P<0.01)。

注:與對照組相比*P<0.05，***P<0.001;與模型組相比△△P<0.01。圖8 參附注射液對膿毒癥小鼠肝組織中ERK1/2及 p-ERK1/2蛋白表達的影響Fig.8 Effects of Shenfu Injection on the LPS-induced protein expressions of ERK1/2 and p-ERK1/2 in the liver tissue of septic

3 討論

膿毒癥是臨床常見的一種危重癥疾病，死亡率較高。雖然抗炎藥物和免疫增強劑例如糖皮質激素和胸腺肽α1等在臨床中應用廣泛，但其不良反應日漸突出[14]。近年來，隨著臨床研究的不斷開展，中醫藥治療膿毒癥得到廣泛認可。其中參附注射液因其回陽救逆、扶正固脫的效果在膿毒癥的治療中被廣泛應用[15]。但是，中藥因其復雜性使研究其作用機制存在一定的困難，所以本文通過網絡藥理學對參附注射液抗膿毒癥的作用機制進行了預測分析，為后續治療和研究提供了新的思路。

本研究由多個數據庫檢索，得到34個活性成分和682個藥物靶點，交集后得到137個抗膿毒癥的潛在靶點，構建PPI網絡并分析參數篩選排名前30的關鍵靶點，包括IL6、MAPK3、TNF、VEGFA、STAT3等。IL-6和TNF-α都是主要的炎性細胞因子，影響膿毒癥炎癥反應進展，與膿毒癥的病死率有一定的相關性[16]。人參皂苷Rh4可以顯著降低LPS誘導的肺損傷小鼠支氣管肺泡灌洗液中的IL-6和TNF-α的表達[17]。山奈酚可以通過抑制IL-6及TNF-α對D-Ga IN糖/LPS誘導的小鼠AHF發揮保護作用[18]。石防風素通過抑制TNF-α在 CCl4誘導的大鼠肝毒性實驗中具有潛在的保肝作用[19]。MAPK3通過MAPK通路來調控細胞生長和分化，還可以影響TNF-α、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)等炎癥因子的表達等[20]。山奈酚可以顯著減弱對乙酰氨基酚誘導的血清TNF-α和IL-6產生，下調JNK 和 ERK磷酸化從而治療急性肝損傷[21]。VEGFA在血管內皮的完整性中起著不可或缺的作用[22]，被證明可誘導血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和ICAM-1的表達，并由于在膿毒癥過程中的表達增加而導致血管內皮損傷和毛細血管滲漏[23]。在患有膿毒癥的成人中，過表達的VEGFA通過與酪氨酸蛋白激酶受體1(tyrosine-protein kinase receptor-1，FLT-1)結合，改變血管內皮細胞骨架的構型而增加了血管通透性。因此，血管內皮易受損，最終導致器官功能障礙[24]。山奈酚增強了人臍靜脈內皮細胞中VEGF誘導的細胞運動，以及斑馬魚胚胎中腸下血管的發芽和大鼠主動脈環中微血管的形成，從而保護血管內皮[25]。STAT3是膿毒癥所致功能障礙的關鍵調控基因之一[26]。研究發現，STAT3在膿毒癥中異常表達，不僅可以直接調控促炎和抑炎因子的表達，還可作用于炎癥信號傳導通路的其他關鍵分子來間接調控膿毒癥的發生發展[27]。山奈酚通過靶向STAT3和NF-κB減輕角叉菜膠誘導的小鼠爪水腫模型[28]。

GO分析表明參附注射液中活性成分可能通過膜筏、膜微區、膜區、胞膜窖、質膜蛋白復合物等細胞組分參與細胞趨化、細胞遷移的正調控、細胞運動的正調控、細胞成分遷移的正調控等生物學過程，發揮蛋白質酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、以羥基為受體的磷酸轉移酶活性、生長因子結合、磷酸酶結合等分子功能。說明參附注射液可能作用于多細胞組分產生不同的生物學功能，進而發揮抗膿毒癥的作用。

KEGG富集分析表明參附注射液抗膿毒癥的潛在靶點主要參與 PI3K-Akt[29]、MAPK[30]、Ras[31]、Rap1[32]和HIF-1[33]等信號通路，這些通路與膿毒癥的發生發展息息相關，說明富集分析的通路具有較高的可信度。

通過體內實驗，證明了參附注射液可以有效抑制膿毒癥小鼠中TNF-α和IL-6的釋放。同時，Western blot結果說明參附注射液可以提高非磷酸化ERK蛋白的表達，降低p-ERK蛋白的表達，從而部分調控MAPK通路，發揮抗膿毒癥作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學分析參附注射液抗膿毒癥的活性成分、潛在靶點和作用機制，發現了參附注射液通過多種方式發揮作用。之后通過分子對接驗證了關鍵成分與相關靶點之間的結合活性，最后通過體內實驗驗證了參附注射液的藥效和調控機制，為參附注射液治療膿毒癥的進一步研究奠定了基礎。