基于網絡藥理學與分子對接探索人參-五味子配伍治療特發性肺間質纖維化的分子機制

顧一丹，任允琰，章朱峰，高平

(無錫市第二中醫醫院 呼吸科，江蘇 無錫 214121)

特發性肺間質纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是特發性間質性肺炎中最常見的類型，是呼吸系統危重癥之一。患者起初僅表現為干咳，隨著肺纖維化加重，出現胸悶、呼吸困難、發紺等臨床表現[1]。肺纖維化不可逆，終末期患者多因心肺功能衰竭失救，目前中位生存期約為3～5年，低于多種癌癥[2]。IPF發病機制尚不明確，目前主要認為與免疫功能紊亂、炎癥反應、氧化應激等密切相關[3]。目前臨床暫無可以治愈IPF的藥物，指南推薦使用尼達尼布或吡非尼酮抗肺纖維化，但該類藥物僅推薦用于輕中度IPF患者，且只能達到延緩肺纖維化的效果，而不能有效改善患者臨床癥狀，療效未能令患者滿意[4- 5]。

中醫藥治療IPF具有一定優勢，相關臨床研究證實中醫藥能改善IPF患者癥狀，提高生存質量[6]。傳統中醫理論無IPF病名，根據臨床癥狀多將IPF歸于“肺萎”范疇，其病機屬本虛標實，重在虛和瘀。目前其辨證分型尚不統一，相關的證型分析研究指出，氣陰兩虛證在患者中占比最大，各醫家臨床治療亦以益氣養陰法施治最為常見，收效令人滿意。人參-五味子配伍出自孫思邈《千金要方》生脈散，有益氣養陰之功效，是臨床常用藥對。現代藥理學研究表明，人參-五味子化學成分具有抗氧化作用，能直接清除活性氧，減輕氧化應激反應[7]；可調節機體免疫[8]，抑制呼吸道炎癥[9]，防治肺癌[10]。目前關于人參-五味子配伍治療IPF的作用機制尚缺乏研究，本文立足中醫藥辨證論治理論，運用網絡藥理學分析與生物信息學數據挖掘理論方法，探索人參-五味子藥對治療IPF的潛在分子機制，以期為IPF的治療提供新的靶點與方向。

1 材料與方法

1.1 特發性肺間質纖維化靶標基因挖掘篩選

以“idiopathic pulmonary fibrosis”為關鍵詞檢索人類基因數據庫(GeneCards)(http://www.genecards.org/)、比較毒物基因組學數據庫(comparative toxicogenomics database，CTD)(http://ctdbase.org/)以及高通量基因表達數據庫(gene expression omnibus data base，GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲得IPF治療靶標基因。從GEO數據庫獲得了編號GSE24206、GSE44723兩個基因芯片的原始數據及對應的GPL基因注釋文件，通過R語言多矩陣平均分析算法對基因芯片進行原始數據背景校正歸一化處理，以表達差異檢驗P<0.05、差異表達倍數(fold change，FC)絕對值>2為條件，運行Limma程序包[11]篩選獲得顯著差異表達的IPF靶標基因。

1.2 人參-五味子藥對活性成分篩選及作用靶標預測

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺[12](Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)分別獲取中藥人參、五味子的全部化學成分，根據口服中藥的藥代動力學ADME[13]參數篩選藥對有效活性成分。設置篩選標準為藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，篩選藥對有效活性成分，并收集其作用靶標基因，使用蛋白組數據庫[14](UniProt Knowledgebase，UniProtKB)(https://www.uniprot.org)對靶標基因進行基因符號Gene Symbol標準化命名。

1.3 基因映射及調控網絡構建

將GeneCards、CTD及GEO獲得的IPF靶標基因分別整理，使用R語言VennDiagram程序包對藥對有效活性成分作用靶標基因與上述獲得的IPF靶標基因取交集，獲得藥對調控的IPF靶標基因。將人參-五味子藥對、有效活性成分及其調控的IPF靶標基因導入網絡可視化分析軟件Cytoscape 3.6.1進行調控網絡構建。分別以不同的節點表示中藥、活性成分及靶標基因，節點間以邊線相聯系代表其從屬或作用關系。

1.4 靶標基因互相作用關系分析及關鍵基因篩選

將藥對調控的IPF靶標基因上傳至STRING數據庫(https://string-db.org/)，進行蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)分析。根據PPI網絡中各靶標基因的度值(degree)大小篩選出其中的關鍵基因。關鍵基因是與較多其他靶標基因發生相互作用的基因，可能是多個相關通路調控多基因發揮多靶點作用的樞紐，在疾病治療的生物學過程中發揮重要作用。

1.5 分子對接驗證

分子對接驗證是通過將藥物化合物分子與基因分子進行三維化合結構的結合，計算其分子對接消耗的能量，以評估分子間穩定結合的潛力[15]。本研究通過對人參-五味子調控IPF的關鍵基因及其相互作用的藥對活性成分進行分子對接驗證，評估藥對活性成分調控IPF關鍵靶標基因的結合潛力。首先從基因蛋白結構數據庫Protein Data Bank(https://www.rcsb.org/)[16]檢索關鍵基因的三維化合結構，下載保存為PDB文件；從有機小分子生物活性數據庫PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[17]獲取藥對活性成分三維結構SDF文件，通過OpenBabel軟件轉化為MOL2文件；將關鍵基因的PDB文件上傳至分子對接預測數據庫SwissDock(http://www.swissdock.ch/)[18]作為對接主體，將藥對活性成分MOL2文件上傳作為配體，進行分子對接預測分析。

1.6 基因本體與信號通路富集分析

采用R語言生物信息學分析Bioconductor工具包對關鍵基因進行基因本體(gene ontology，GO)[19]生物學注釋過程富集分析與京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)[20]信號通路富集分析，預測人參-五味子治療IPF的潛在分子機制。

2 結果

2.1 特發性肺間質纖維化靶標基因

GSE24206、GSE44723基因芯片共包含22例IPF病人與10例正常組病人的肺組織樣本測序數據，運行Limma包對基因表達數據進行對比分析，共篩選獲得140個顯著差異表達基因，其中差異倍數(fold change,FC)>2的上調基因78個，FC<-2的下調基因62個。根據P值及FC值繪制差異基因表達火山圖(圖1(a))。以“idiopathic pulmonary fibrosis”為關鍵詞于GeneCards、CTD數據庫檢索分別獲得2754、2395個IPF疾病靶標基因。

2.2 人參-五味子藥對活性成分及作用靶標基因

在TCMSP平臺分別檢索人參、五味子的活性成分，根據OB≥30%、DL≥0.18的藥代動力學參數篩選獲得藥對有效活性成分42個，對應不同疾病靶標基因92個。將獲得的藥對靶標基因與上述獲得的IPF疾病靶標基因通過VennDiagram程序包取交集，獲得藥對調控IPF靶標基因48個，見圖1(b)。共有23個藥對有效活性成分參與調控上述48個IPF靶標基因，如表1所示。

圖1 人參-五味子藥對活性成分調控IPF靶點基因Fig.1 IPF target genes of Ginseng Radix Et Rhizoma-Schisandrae Chinensis Fructus couple medicine

序號成分代碼成分名稱OB/%DL來源1MOL002879己二酸二異辛酯43.590.39人參2MOL000449豆甾醇43.830.76人參3MOL000358β-谷甾醇36.910.75人參4MOL003648高麗槐素65.830.54人參5MOL000422山柰酚41.880.24人參6MOL005308阿樸天仙子堿66.650.22人參7MOL005318石竹胺40.450.2人參8MOL005320花生四烯酸45.570.2人參9MOL005321佛丁酮A65.90.34人參10MOL005344人參皂苷rh236.320.56人參11MOL005348人參皂苷-Rh4苷元31.110.78人參12MOL005356吉九里香堿61.220.31人參13MOL005376人參萜二醇33.090.79人參14MOL005384蘇卡內酯57.520.56人參15MOL005399胡蘿卜甙36.910.75人參16MOL000787藍堇堿59.260.83人參17MOL005317脫氧三尖杉酯堿39.270.81共同18MOL008957五味子素B30.710.83五味子19MOL008968五味子醇A30.690.78五味子20MOL008978五味子醇R34.840.86五味子21MOL008992五味子素C46.270.84五味子22MOL009213五味子木脂素B30.630.84五味子23MOL009220新南五味子素33.350.88五味子

2.3 藥對-活性成分-靶標基因調控網絡可視化

將人參-五味子藥對、23個有效活性成分及48個IPF靶標基因共同導入至Cytoscape軟件中，構建藥對-活性成分-靶標基因調控網絡，將結果輸出為可視化網絡，如圖2所示。該調控網絡包含73個節點和144條邊線，共同構成復雜調控網絡。

圖2 人參-五味子藥對-活性成分-IPF靶標基因調控網絡Fig. 2 Network of Ginseng RadixEt Rhizoma-Schisandrae Chinensis Fructus couple medicine-active ingredients-IPF target genes

2.4 靶標基因互相作用網絡關鍵基因篩選

將48個IPF靶標基因上傳至STRING網站，設置物種為“Homo sapiens”(人類)，最小互作分數為0.4，進行PPI網絡構建及分析，使用R語言對靶標基因在網絡中的度值進行統計，根據度值大小進行排序，篩選其中度值最高的前20位靶標基因為網絡的關鍵基因，并以條形圖呈現，見圖3。

圖3 靶標基因度值排序(前20位)Fig. 3 Sequence diagram of target genes′ degree (Top 20)

2.5 關鍵基因GO富集分析

將關鍵基因進行整理，使用R語言clusterProfiler程序包進行GO生物學注釋過程富集分析，篩選檢驗統計P<0.05的基因產物注釋過程，并按照P值從小到大進行排序，以可視化圖形展示排名前20位的GO過程。如圖4所示，關鍵基因主要富集于核受體活性、類固醇激素受體活性、血紅素結合、RNA聚合酶II轉錄因子結合、Hsp90蛋白結合等GO生物學過程。

圖4 關鍵基因GO富集結果(前20)Fig.4 Enriched GO processes of hub genes(Top 20)

2.6 關鍵基因KEGG信號通路富集分析

運行R語言clusterProfiler程序包對關鍵基因進行KEGG信號通路富集分析，設置物種歸屬為“hsa”(人類)，以Benjamini校正法對富集通路檢驗統計進行校正，篩選P<0.05的通路并根據P值從小到大排序，列表展示富集程度最高的前10個信號通路，見表2。

表2 關鍵基因KEGG信號通路富集分析(前10位)Table 2 Enriched KEGG pathways of hub genes (Top10)

2.7 分子對接分析

本研究通過SwissDock平臺將排名前5位的關鍵基因(AKT1、PTGS2、IL1B、MAPK8、CASP3)與其相互作用的人參-五味子活性成分進行分子對接驗證，結果見表3。關鍵基因與藥對活性成分分子對接能量ΔG大致波動在-26～-40 kJ/mol范圍內，認為兩者總體能穩定對接結合，是人參-五味子有效調控IPF關鍵基因的重要物質基礎。

表3 分子對接驗證結果Table 3 Results of molecular docking

3 討論

中醫學將IPF歸于“肺萎”范疇，《金匱要略心典》總結“痿者萎也，如草木之萎而不榮，為津爍而肺焦也”，指出肺萎的根本病機為肺臟氣陰虧損。《神農本草經》記載 “人參，味甘微寒，主補五臟，安精神，定魂魄”，《本草別錄》記載“五味子，養五臟，除熱，生陰中肌“，人參-五味子是經典的益氣養陰藥物配伍，被廣泛應用于氣陰虧損所致的喘逆哮咳等呼吸系統疾病的治療中[21]，在IPF治療中具有良好的前景。

本研究立足中醫辨證論治觀念，借助網絡藥理學研究方法，共篩選出人參-五味子藥對含有人參萜二醇、五味子素B等23個有效活性成分，作用于48個IPF靶標基因，通過多成分、多靶點、多通路的調控網絡，從調控免疫功能、抑制纖維化、抗氧化應激、抑制炎癥等幾方面發揮治療IPF的作用。

活性成分山奈酚分別與NOS2、PTGS1、PTGS2等多個靶標基因發生相互作用，是調控網絡中連接度最高的活性成分，研究認為山奈酚具有抑制炎癥、抗氧化應激的作用[22]，PTGS1、PTGS2是前列腺素內過氧化物合酶同工酶，山奈酚可能通過PTGS1、PTGS2參與上調炎癥產物環氧合酶(COX-2)表達，促進抗纖維化代謝產物 PGE2生成，發揮抗IPF作用[23]；生物利用度較高的吉九里香堿具有抑制細胞凋亡、抗炎等保護作用[24]；人參皂苷Rh2通過調控IL1B介導的免疫反應改善機體免疫功能[25]；人參、五味子共有成分脫氧三尖杉酯堿在肺癌相關研究中表現出良好的肺間質細胞保護特性[26]。

關鍵基因富集的KEGG信號通路結果顯示，富集基因數目最多、顯著性最高的白介素17信號通路，下游通路中由多種IL-17亞家族蛋白參與調控CD4+、CD8+等多種T淋巴細胞的增殖凋亡及自身免疫反應，關鍵基因IFNG、IL-1B等共同參與不同環節信號轉導。相關研究表明，IPF患者外周血中IL2、血清干擾素IFNG水平明顯下降，CD4+淋巴細胞比例下降，CD8+淋巴細胞增加，免疫功能明顯紊亂，可能與IL-17信號通路的調控密切相關[27]。關鍵基因PPARG富集于過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路，PPAR屬于核受體超家族，其下游活化可產生抗炎、調控代謝活動等效應。有研究表明，PPARG配體可抑制轉化生長因子β(TGF-β)對肺成纖維細胞的活化刺激及膠原蛋白的分泌，抑制氧化應激損傷[28]。劉豹等[29]研究發現益氣養陰方劑麥門冬湯含有PPARG激活劑，有助于抑制IPF肺纖維化進程。炎癥反應可能是IPF發病的關鍵環節[30]，關鍵基因在腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、核因子KB(NF-kappa B)及TGF信號通路等經典炎癥相關通路中均有較顯著的富集。研究表明TGF-β、TNF-α是促進成纖維細胞增殖的關鍵炎癥因子，并可介導肺泡上皮細胞凋亡壞死，益氣養陰方劑在IPF大鼠模型試驗中降低TGF-β、TNF-α的表達，抑制炎癥反應[31]。

本研究通過預測分析，發現人參-五味子的23個活性成分參與調控48個IPF疾病靶點基因，其中的關鍵基因AKT1、PTGS2、IL1B、MAPK8、CASP3等可能通過參與IL17、PPAR、TNF信號通路等在調控免疫功能、抑制纖維化、抗氧化應激、抑制炎癥等幾方面發揮抗IPF的作用，人參-五味子治療IPF存在多成分、多靶點、多通路的特點。但本研究僅基于網絡藥理學理論進行數據預測分析，不涉及藥物成分在機體的代謝變化及協調作用，存在一定局限性，后續仍需進一步實驗以驗證人參-五味子抗IPF的具體作用機制。