多菌種混合發酵的西瓜酒生產工藝

任繼波，張永春，孫運奇，蔡夢云，高德艷，張紅*

(1. 齊魯工業大學(山東省科學院) 山東省科學院菏澤分院 山東省生物工程技術創新中心，山東 菏澤 274000； 2. 齊魯工業大學(山東省科學院) 化學與化工學院，山東 濟南 250353；3. 山東省葡萄研究院，山東 濟南 250100)

西瓜為葫蘆科植物西瓜Citrulluslanatus(Thunb.)Matsumu.et Nakai的果實，瓜呈圓形或橢圓形，瓤多汁而甜，呈濃紅、淡紅、黃或白色[1]。西瓜在我國南北皆有栽培，被稱為“瓜中之王”，其味甘多汁，清爽解渴，是消夏佳果。西瓜含有大量葡萄糖、蘋果酸、果糖、氨基酸、番茄素及豐富的維生素C、鉀鹽等20余種有益健康的物質，不含脂肪和膽固醇，營養價值十分豐富[2](表1)。中醫學認為，西瓜甘淡性寒，能清熱解暑、止渴解煩，通利小便，《日用本草》就提到西瓜寬中下氣利小水，治四痢。西瓜中含有的番茄紅素是類胡蘿卜素中的一種，具有很強的抗氧化作用，可以延緩衰老、美容養顏，對胃癌、皮膚癌、乳腺癌以及心腦血管疾病都具有一定的預防作用[3]。

表1 西瓜主要營養成分的質量分數Table 1 Main nutrients and contents of watermelon

西瓜是一種季節性很強的水果，其產期集中、產量大，且存在不宜長期儲存、瓜汁易氧化等問題[4]。用西瓜汁做成發酵酒飲料，不僅可以解決上述問題，而且可以很好地促進西瓜深加工產業和種植業的發展，帶動農民生產的積極性[5]。本研究創新性地采用多菌種協同發酵工藝生產西瓜酒飲料，為西瓜的進一步開發利用提供思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

新鮮西瓜(市售)；白砂糖(山東凌雪糖業進出口有限公司)；Zymaflore X5釀酒酵母(法國Laffort公司)；DV10釀酒酵母(法國Lalvin公司)；Lactoenos SB3乳酸菌(法國Laffort公司，)、果膠酶(北京索萊寶科技有限公司，酶活30 U/mg)；食品級皂土(法國Laffort公司)、食品級蛋清粉(法國Laffort公司)、食品級維生素C(江蘇采薇生物科技有限公司)、食品級無水檸檬酸(濰坊英軒實業有限公司)、食品級焦亞硫酸鉀(淄博百大化工有限公司)。

1.1.2 儀器

L18-Y915S型榨汁機(九陽股份有限公司)；HHS-11-1型恒溫水浴鍋(常州諾基儀器有限公司)；HVS-1300超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；JC100型高壓滅菌鍋(山東德強電力工程有限公司)；PHSJ-5型pH計(上海雷磁儀器有限公司)；ICS445型電子天平(梅特勒-托利多精密儀器有限公司)；SPX-150B型生化培養箱(常州諾基儀器有限公司)；DLSB-10/20型低溫冷卻液循環泵(鞏義予華儀器有限公司)；XZJL-20型板框式過濾機(新鄉新輕機械有限公司)；SY-1S型實驗室膜過濾機(紹興海納膜技術有限公司)；GBJL-10L型發酵罐(鎮江東方生工生物工程設備技術有限公司)；10 L儲酒罐、5 L冷凍罐(石家莊恒昌食品包裝機械有限公司)。

1.2 測定方法

本工藝生產的西瓜酒理化、微生物指標參照國標GB 2758—2012《發酵酒及其配制酒》[6]執行。酒體理化指標測定方法如下：

總糖的測定(以葡萄糖計，g/L)：按國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[7]執行；

總酸的測定(以酒石酸計，g/L)：按GB/T 15038—2006執行；

酒精度的測定(以酒精體積分數計，%)：按GB/T 15038—2006執行；

SO2濃度的測定(以質量濃度計，mg/L)：按GB/T 15038—2006執行。

西瓜酒感官品評參照國標GB 15037—2006《葡萄酒》[8]，具體方法見表2。

表2 西瓜酒感官評定方法Table 2 Sensory assessment of watermelon wine

1.3 試驗工藝

西瓜酒制備工藝流程如圖1所示。

圖1 西瓜酒制備工藝流程圖Fig.1 Preparation process of watermelon wine

西瓜經篩選、清洗、去皮、去籽后進行壓榨得到西瓜汁，壓榨過程中添加維生素C、檸檬酸防氧化。西瓜汁經酶解、過濾、滅菌后調整成分，接種Lalvin DV10、Zymaflore X5兩株菌種進行主發酵。主發酵結束后加皂土澄清過濾，濾液接種Lactoenos SB3進行二次發酵。二次發酵結束后加蛋清粉進行二次下膠過濾，之后得到西瓜原酒。西瓜原酒經陳釀、冷凍過濾后裝瓶，得到西瓜酒成品。

1.4 多菌株不同接種量的單因素試驗

西瓜酒發酵工藝采用多菌種協同發酵，通過單因素試驗確定不同酵母菌、乳酸菌接種量對酒體品質的影響。

1.4.1 釀酒酵母(Zymaflore X5)接種量對西瓜酒發酵的影響

在Lalvin DV10接種量50 mg/L、Lactoenos SB3接種量30 mg/L、初始醪液pH 4.0、游離SO2質量濃度60 mg/L、主發酵溫度22 ℃(8 d)、二次發酵溫度18 ℃(15 d)條件下，Zymaflore X5接種量分別為100、200、300、400、500 mg/L，發酵生產西瓜酒，并于二次過濾后測定不同的Zymaflore X5接種量對酒度、酸度、殘糖量的影響。

1.4.2 釀酒酵母(Lalvin DV10)接種量對西瓜酒發酵的影響

在Zymaflore X5接種量100 mg/L、Lactoenos SB3接種量30 mg/L、初始醪液pH 4.0、游離SO2質量濃度60 mg/L、主發酵溫度22 ℃(8 d)、二次發酵溫度18 ℃(15 d)條件下，Lalvin DV10接種量分別為50、150、250、350、450 mg/L，發酵生產西瓜酒，于二次過濾后測定不同的Lalvin DV10接種量對酒度、酸度、殘糖量的影響。

1.4.3 乳酸菌(Lactoenos SB3)接種量對西瓜酒發酵的影響

在發酵溫度20 ℃、Zymaflore X5接種量100 mg/L、Lalvin DV10接種量50 mg/L、初始醪液pH 4.0、游離SO2質量濃度60 mg/L、主發酵溫度22 ℃(8 d)、二次發酵溫度18 ℃(15 d)條件下，Lactoenos SB3接種量分別為10、20、30、40、50 mg/L，發酵生產西瓜酒，并于二次過濾后測定不同的Lactoenos SB3接種量對酒度、酸度、殘糖量影響。

1.5 多菌株不同接種量的正交試驗

為進一步研究各菌株不同接種量對西瓜酒品質的影響，在單因素試驗結果的基礎上，以酒精度為指標設計正交試驗，確定最佳菌株接種量組合。

2 結果與分析

2.1 工藝操作要點

2.1.1 西瓜的選擇與預處理

選用的西瓜新鮮、成熟、完整無劃痕，含糖量為126 g/L。西瓜皮要去除干凈以防其影響榨汁后果汁的味道[9]。此外，瓜籽也要去除干凈，因為瓜籽中含有的脂質、多糖等成分會影響最終發酵產品的風味[10]。西瓜的去皮、去籽、榨汁要迅速，盡量減少西瓜汁的氧化，處理過程中向西瓜汁中加入質量分數0.01%的維生素C和0.2%的檸檬酸作為護色劑。

2.1.2 西瓜汁的預處理

榨出的西瓜汁加入質量分數0.09%的果膠酶，以提高果汁的澄清度。西瓜中含有乙醛、己酸、單乙胺、甲硫醇等物質，這些物質的存在會對西瓜酒的品質產生不良的影響，因此在接種發酵前須除去。通過加熱的方式，可除去西瓜汁中大部分的醛類、乙胺類、硫醇等物質[11]。此外，對西瓜汁進行熱處理同時可起到滅菌、濃縮的作用，有利于后續發酵。

滅菌結束后，要進一步對西瓜汁的成分進行調整，用白砂糖調瓜汁的含糖量為160 g/L，用檸檬酸調pH為3.5～4.0。為抑制細菌的生長繁殖，加焦亞硫酸鉀調節瓜汁游離SO2質量濃度為60 mg/L。

2.1.3 接種發酵

西瓜汁的發酵過程分為主發酵和后發酵。

主發酵采用兩種釀酒酵母(Zymaflore X5、Lalvin DV10)協同發酵，接種前應事先分別將兩種酵母菌用調配好的西瓜汁進行活化30 min，再加入到西瓜汁中，接種量控制在100～500 mg/L。主發酵溫度為22 ℃，發酵時間為8 d。

后發酵也叫二次發酵，所用菌種是乳酸菌(Lactoenos SB3)。通過二次發酵可以很好地消除酒體酸澀、粗糙等特點，并提高酒體的生物穩定性，改善風味[12]。乳酸菌接種量控制在10～50 mg/L，接種前要求醪液中游離SO2的ρ(SO2)<30 mg/L，總SO2的ρ(SO2)<60 mg/L。發酵溫度為18 ℃，發酵時間為15 d。發酵結束后立即添加焦亞硫酸鉀，使醪液中游離SO2質量濃度達到60～80 mg/L，以抑制乳酸菌生長結束二次發酵。

2.1.4 下膠過濾

主發酵結束后要對發酵液立即進行下膠處理，以除去醪液中殘留的酵母菌體，而后轉入后發酵。澄清劑選用食品級皂土，添加量為1000 mg/L。皂土使用時先用50 ℃純凈水充分溶脹，緩慢加入到酒體中并不斷攪拌。下膠的酒體在15 ℃下放置48 h后過濾得到清酒液。

二次發酵結束后下膠選用的澄清劑為蛋清粉。蛋清粉是用新鮮雞蛋清經干燥獲得的，呈白色細末狀。在溶液中，蛋白可與酚類物質形成沉淀而增加酒體穩定性，能有效改善酒體的結構感，使酒體圓潤豐滿并且保持芳香特征[13]。蛋清粉添加量為60 mg/L，使用時先將蛋清粉加10倍質量的常溫純凈水溶解，3 h后加入酒體中并攪拌均勻。下膠的酒體在15 ℃下放置14 d后過濾得到清酒液。

2.1.5 陳釀

發酵結束得到的酒體較為粗糙，口感欠佳，需經過陳釀處理[14]。過濾澄清的酒體儲存于玻璃瓶中密封，于12 ℃避光環境下靜置20 d，以改善酒體口感、豐富香氣[15]。

2.2 單因素試驗

2.2.1 釀酒酵母(Zymaflore X5)最佳接種量的確定

Zymaflore X5不同接種量對發酵的影響見表3。

表3 Zymaflore X5不同接種量對西瓜酒發酵的影響Table 3 Effects of different inoculation amounts of Zymaflore X5 on the fermentation process

從表3可以看出，酒精度隨著Zymaflore X5接種量的增加逐漸升高，當接種量高于300 mg/L時，酒精度有降低趨勢，且酒體酸度升高明顯。主要是因為過高的接種量會使發酵醪液中有限的營養物質被酵母菌體生長繁殖所利用，且過量的菌體生長導致有機酸代謝增多，不利于酒體風味物質的產生[16]。因此，選擇Zymaflore X5接種量為300 mg/L。

2.2.2 釀酒酵母(Lalvin DV10)最佳接種量的確定

Lalvin DV10不同接種量對發酵的影響見表4。

表4 Lalvin DV10不同接種量對西瓜酒發酵影響Table 4 Effects of different inoculation amounts of Lalvin DV10 on the fermentation process

從表4可以看出，酒精度隨Lalvin DV10接種量的增加逐漸升高，當接種量高于250 mg/L時，酒精度有下降趨勢，總酸質量濃度增加顯著。分析原因與Zymaflore X5菌種相似，過高的接種量導致酵母菌生長過量，且Lalvin DV10菌種在高接種量時產酸增加，對酒體口感產生不利影響。因此選擇Lalvin DV10接種量為150 mg/L。

2.2.3 乳酸菌(Lactoenos SB3)最佳接種量的確定

Lactoenos SB3不同接種量對發酵的影響見表5。

表5 Lactoenos SB3不同接種量對西瓜酒發酵的影響Table 5 Effects of different inoculation amounts of Lactoenos SB3 on the fermentation process

從表5可以看出，此發酵條件下Lactoenos SB3不同接種量對酒精度影響不明顯，對總酸質量濃度影響較大。這是因為乳酸菌Lactoenos SB3接種于二次發酵，此時酒精發酵(即主發酵)已基本結束，乳酸菌的主要作用是降低酸度并通過菌體代謝產生風味物質以豐富酒體口感。由于乳酸菌較酵母菌在使用成本上更高、使用條件更為苛刻，因此Lactoenos SB3接種量選擇30 mg/L較適宜。

2.3 正交優化試驗

在單因素試驗結果基礎上，采用三因素三水平正交試驗設計(表6)，考察Zymaflore X5接種量(因素A)、Lalvin DV10接種量(因素B)、Lactoenos SB3接種量(因素C)對西瓜酒酒精度的影響，并對試驗結果進行直觀分析和方差分析以確定最佳接種量。優化試驗組合與結果見表7。以空白列作為試驗誤差進行方差分析，結果見表8。

表6 正交試驗因素水平表Table 6 Table of factors in orthogonal test

表7 優化試驗組合與結果Table 7 Combination and results of the optimization test

表8 正交試驗方差分析表Table 8 Analysis of variance of orthogonal test

從表7直觀分析可知，對酒精度影響最大的是Lalvin DV10接種量，其次是Zymaflore X5，再次是Lactoenos SB3。從表8方差分析可知，因素B的p值<0.1，對試驗結果影響具有顯著性，A、C兩個因素無顯著性影響。因此只需對有顯著影響的B因素選擇最佳水平，其他因素可按實際需要選擇適當水平。綜合直觀分析和方差分析結果，確定西瓜酒發酵最佳的菌株接種量組合是A1B3C2，即Zymaflore X5接種量250 mg/L、Lalvin DV10接種量200 mg/L、Lactoenos SB3接種量30 mg/L。

在最佳菌株接種量組合條件下，平行發酵生產三組西瓜酒，三組平行產品主要指標如表9所示。通過表9可以得出，該工藝生產的西瓜酒酒精度可達(8.77±0.15)%，總酸質量濃度(1.7±0.10) g/L，殘糖質量濃度(3.97±0.15) g/L。

2.4 感官品評

根據西瓜酒感官品評方法(表2)，邀請三名品酒師對在最佳菌株接種量組合條件下生產的西瓜酒進行感官品評。感官品評得分如表10所示。

表10 西瓜酒感官品評得分Table 10 Sensory score of the watermelon wine

該工藝生產的西瓜酒酒液呈橘紅色，清亮有光澤，具有西瓜果實特有的香氣，口感醇厚純凈而無異味，酒體協調，具有西瓜酒應有的特征和風味，綜合平均得分92。

3 結論

本研究以西瓜為原料，采用多菌種聯合發酵工藝生產西瓜酒。在單因素試驗基礎上采用正交優化試驗對三株發酵菌株的最優接種量配比進行了優化，結合直觀分析、方差分析確定最佳菌株接種量組合為：Zymaflore X5接種量250 mg/L、Lalvin DV10接種量200 mg/L、Lactoenos SB3接種量30 mg/L。在此工藝條件下生產的西瓜酒酒精度達到(8.77±0.15)%，總酸質量濃度(1.7±0.10) g/L，殘糖質量濃度(3.97±0.15) g/L。酒液呈橘紅色，通體透亮有光澤，具有純正清爽的西瓜果實香，口感細膩、純凈，感官評定綜合得分92。

采用該工藝路線生產西瓜酒，工藝操作簡便靈活，多菌種混合發酵在保證西瓜酒酒精度的同時使酒體更加豐滿，得到的產品在色澤、口感、香氣等方面特點突出，是一款符合現代人消費理念的健康飲品，市場推廣前景廣闊。