中華疣海星中化學(xué)成分的分離和鑒定

陸云陽 李虎 劉楊 田韻遠 胡晉銘 邱鵬程 湯海峰

海星(starfish)是一類無脊椎底棲海洋動物，以魚蝦貝類為食，屬于棘皮動物門(Echinodermat)海星綱(Asteroidea)。據(jù)統(tǒng)計全球現(xiàn)存海星1900余種，分屬于項鏈海星目(Brisingida)、鉗棘目(Forcipulatida)、樁海星目(Paxillosida)、有棘目(Spinulosida)、瓣海星目(Valvatida)、帆海星目(Velatida)和Notomyotida等7目，共36科約370屬，其中生活在中國周邊海域的約120余種[1]。海星入藥最早見于《本草綱目》，主要作為中國沿海地區(qū)的民間用藥[2]。《中華海洋本草》記載其具有軟堅散結(jié)、和胃止痛之功效，主要用于治療甲狀腺腫大、淋巴結(jié)核、癭瘤、瘰疬、胃痛泛酸等癥[3]。化學(xué)研究表明海星含有甾體、甾體皂苷、蒽醌、生物堿、多肽、磷脂和脂肪酸等多類成分，這些化合物具有腫瘤細胞毒性、溶血、抗病毒、抗真菌和抗其他微生物等多種生物活性[4-6]。中華疣海星(Pentacerasterchinensis)屬于瓣海星目瘤海星科(Oreasteridae)疣海星屬，是在中國南海海域發(fā)現(xiàn)的特有種，而且分布廣泛[7]。目前，針對中華疣海星的化學(xué)成分研究報道較少[8-9]。為了闡明其化學(xué)成分，為其科學(xué)的開發(fā)利用提供依據(jù)，在前期課題組對中華疣海星中的甾體皂苷類成分研究的基礎(chǔ)上[10-11]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE III 500 MHz核磁共振波譜儀(Bruker，德國)；Micromass Quattro質(zhì)譜儀(Waters，美國)；Dionex P680高效液相色譜儀(Dionex，德國)[配YMC Pack ODS-A色譜柱(250 mm × 20 mm，5 μm；250 mm × 4.6 mm，5 μm)]；Sartorius電子天平(賽多利斯，德國)；柱色譜硅膠100～200目、300～400目(青島海洋化工有限公司，中國)；Sephadex LH-20凝膠(GE Health Care，美國)；C18反相硅膠(Merck，德國)；色譜純乙腈(天津科密歐公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 動物樣本

中華疣海星于2015年3月采集于海南省瓊州市以東海域，經(jīng)中國科學(xué)院海洋研究所肖寧博士鑒定為中華疣海星Pentacerasterchinensis，標本保存于中國科學(xué)院海洋生物標本館。

1.3 提取分離

1.3.1 中華疣海星的提取 中華疣海星總重12 kg(濕重)，鍘刀切碎后用75%乙醇回流提取3次，每次2小時。然后合并3次提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾，回收乙醇得浸膏。將乙醇浸膏均勻分散于純水中，用等體積的石油醚萃取5次，以除去脂溶性成分。然后，用水飽和正丁醇萃取5次，回收水飽和正丁醇層，即得正丁醇萃取物88 g。

1.3.2 單體化合物的分離 正丁醇萃取物溶解后用硅膠拌樣，然后上硅膠柱色譜進行分離純化，用氯仿—甲醇—水(40∶1∶0 ～ 6.5∶3.5∶1)梯度洗脫，每500 mL收集一次洗脫液，旋蒸后用薄層色譜展開，顯色劑檢測后合并，總共得19個部分Fr.A-Fr.S。Fr.G(4.47 g)部分，先用Sephadex LH-20凝膠柱色譜純化，氯仿—甲醇(1∶1)等度洗脫以除去雜質(zhì)。然后用C18反相硅膠柱色譜進行分離，洗脫液為甲醇—水(1∶3 ～ 1∶0)梯度洗脫，收集洗脫液，每100 mL為一個組分，旋蒸后用薄層色譜展開，顯色劑檢測后進行合并，最終一共合并得到3個部分(Fr.G1 ～ Fr.G3)。其中Fr.G2(60.5 mg)通過半制備高效液相色譜進行分離純化，流動相為68%乙腈水溶液(加0.05%三氟乙酸)，流速6 mL/min，分離得到化合物1(4.0 mg)和2(9.6 mg)。

Fr.H(2.94 g)部分用Sephadex LH-20凝膠柱進行純化，氯仿—甲醇(1∶1)等度洗脫以除去雜質(zhì)。經(jīng)過凝膠柱純化后的Fr.H部分繼續(xù)上C18反相硅膠柱色譜進行分離，洗脫液為甲醇—水(1∶3 ～1∶0)，收集洗脫液，旋蒸后用薄層色譜展開，顯色劑檢測后進行合并，最終從Fr.H部分共得到3個部分(Fr.H1 ～ Fr.H3)。其中Fr.H2(85 mg)通過半制備高效液相色譜進行分離純化，流動相為70%乙腈水溶液(加0.05%三氟乙酸)，流速6 mL/min，分離得到化合物3(15.0 mg)和4(12.2 mg)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

通過綜合分析分離所得化合物1～4的核磁和質(zhì)譜數(shù)據(jù)，解析出其化學(xué)結(jié)構(gòu)(圖1)。詳細解析過程如下。

2.2 化合物1

化合物1，白色粉末，Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽性，表明其可能是甾體類化合物。電噴霧質(zhì)譜(Electron Spray Ionization-Mass Spectrum, ESI-MS)給出其準分子離子峰為m/z457 [M + Na]+和m/z433 [M - H]-，結(jié)合化合物的核磁共振碳譜(13C Nuclear Magnetic Resonance,13C NMR)數(shù)據(jù)，推測其分子式為C27H46O4。

綜合分析其1H NMR和13C NMR信號，發(fā)現(xiàn)化合物分子中存在5個甲基，其碳氫化學(xué)位移分別為δH0.98 (s)與δC15.2 (C-18)、δH0.89 (s)與δC14.0 (C-19)、δH1.01 (d,J= 6.3 Hz)與δC20.4

圖1 從中華疣海星中分離鑒定到的

(C-21)、δH0.91 (d,J= 6.5 Hz)與δC18.6、δH0.86(d,J= 6.5 Hz)與δC18.5；一個雙鍵δH5.52與δC138.5和δH5.42 (dd,J= 14.8, 6.8 Hz)與δC130.2；以及4個連氧次甲基δH3.48與δC72.3、δH3.39與δC69.8、δH4.12與δC70.5、δH3.65與δC78.7。以上特征NMR信號表明化合物1可能是一個多羥基甾醇類化合物。根據(jù)1H NMR、13C NMR、DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer)和HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence)譜數(shù)據(jù)，對化合物的所有碳氫信號進行了歸屬(表1)。根據(jù)化合物1H-1H COSY(1H-1H correlation spectroscopy)譜的相關(guān)信號，可以得到連續(xù)的結(jié)構(gòu)片段：H-1/H-2/H-3/H-4/H-5/H-6/H-7/H-8/H-9、H-9/H-11/H-12、H-8/H-14/H-15/H-16/H-17、H-17/H-20/H-21、H-20/H-22/H-23/H-24/H-25/H-26/H-27。在HMBC譜中H3-19與C-1、C-5、C-9和C-10相關(guān)，H3-18與C-12、C-13、C-14和C-17相關(guān)，H3-21與C-17、C-20和C-22相關(guān)，H3-26與C-24、C-25和C-27相關(guān)；H-22與C-17和C-20相關(guān)，H-23與C-20、C-24和C-25相關(guān)，從而可構(gòu)建化合物1的平面結(jié)構(gòu)，并表明雙鍵位于C-22(C-23)位。根據(jù)H-23的偶合常數(shù)J= 14.8推測雙鍵為反式構(gòu)型。在NOESY(Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy)譜中，H-3與H-5相關(guān)，表明H-3為α構(gòu)型；H-6與H-8和H3-19相關(guān)，表明H-6是β構(gòu)型；H-14與H-15和H-17相關(guān)，表明H-15是α構(gòu)型。通過與文獻中具有22E-雙鍵-24-羥基的化合物中C-24位碳氫核磁數(shù)據(jù)的對比，表明化合物1的C-24為R構(gòu)型。綜上所述，鑒定化合物1的結(jié)構(gòu)為(24R, 22E)-膽甾-22-烯-3β,6α,15β,24-四醇，即已知化合物certonardosterol G，其波譜數(shù)據(jù)與文獻一致[12]。

2.3 化合物2

化合物2，白色無定形粉末，Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽性，表明其可能是甾體類化合物。ESI-MS給出其準分子離子峰為m/z473 [M+Na]+和m/z449 [M-H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜數(shù)據(jù)，推測其分子式為C27H46O5。

化合物的1H NMR譜中存在5個甲基氫信號，包括2個單峰甲基氫δH0.96和1.28、3個雙峰甲基氫δH0.88 (J=6.7 Hz)、0.90 (J=6.7 Hz)和0.99 (J=6.5 Hz)。還存在2個烯氫信號δH5.53、δH5.45 (dd,J=15.0, 6.5 Hz)；4個連氧次甲基氫信號δH3.48、3.65、3.86和4.40。通過HSQC譜找到與以上氫信號對應(yīng)的甲基碳信號分別為δC14.2、16.5、18.6、18.5和20.4，雙鍵碳信號為δC138.6和132.5，連氧次甲基碳信號為δC72.0、78.9、68.2和70.5。根據(jù)1H NMR、13C NMR、DEPT和HSQC譜數(shù)據(jù)，對化合物2的所有碳氫信號進行了歸屬(表1)。對比化合物2與化合物1的核磁數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)這兩個化合物具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。不同點在于與化合物1相比，化合物2的碳信號中少了一個δC32.2次甲基碳信號，多了一個δC77.7連氧季碳信號。2D NMR分析表明，化合物2為化合物1的C-8位羥基取代產(chǎn)物，由生源途徑分析推測8-OH為β構(gòu)型。因此，確定化合物2的結(jié)構(gòu)為(24R, 22E)-膽甾-22-烯-3β,6α,8β,15β,24-五醇，其波譜數(shù)據(jù)與文獻中報道的已知化合物一致[13]。

2.4 化合物3

化合物3，白色無定形粉末，Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽性，表明其可能是甾體類化合物。ESI-MS給出其準分子離子峰為m/z475 [M + Na]+和m/z451 [M-H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜數(shù)據(jù)，推測其分子式為C27H48O5。

分析化合物的1H NMR和13C NMR譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)化合物分子中存在4個甲基信號，碳氫化學(xué)位移分別為δH0.93 (s)與δC16.4 (C-18)、δH0.85 (s)與δC13.6 (C-19)、δH0.96 (d,J= 6.5 Hz)與δC18.3 (C-21)、δH0.95 (d,J= 6.8 Hz)與δC17.6 (C-27)；另有4個連氧次甲基信號，碳氫化學(xué)位移分別為δH3.49與δC71.9、δH3.35與δC69.8、δH4.12與δC70.3、δH4.29與δC72.8；1個連氧亞甲基δH3.55 (dd,J= 10.3, 5.7 Hz)/3.68 (dd,J= 10.1, 6.8 Hz)與δC67.9。以上特征信號表明化合物3是一個多羥基甾醇類化合物。根據(jù)1H NMR、13C NMR、DEPT和HSQC譜數(shù)據(jù)，對化合物3的所有碳氫信號進行了歸屬(表1)。結(jié)合2D NMR分析，通過檢索發(fā)現(xiàn)化合物3與文獻報道的化合物(25S)-膽甾-3β,6α,15β,16β,26五醇波譜數(shù)據(jù)一致，從而確定了其結(jié)構(gòu)[14]。

表1 化合物1～4的13C NMR (CD3OD, 125 MHz)和1H NMR (CD3OD, 500 MHz)數(shù)據(jù)

2.5 化合物4

化合物4，白色粉末，Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽性，表明其可能是甾體類化合物。ESI-MS給出其準分子離子峰為m/z491 [M + Na]+和m/z467 [M-H]-，結(jié)合化合物的13C NMR譜數(shù)據(jù)，推測其分子式為C27H48O6。

根據(jù)化合物4的1H NMR、13C NMR、DEPT和HSQC譜數(shù)據(jù)，對其所有的碳氫信號進行了歸屬(表1)。分析上述數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，化合物分子結(jié)構(gòu)中有4個甲基信號，其碳氫化學(xué)位移分別為δH1.19 (s)與δC17.6 (C-18)、δH0.98 (s)與δC13.7 (C-19)、δH0.95 (d,J= 6.0 Hz)與δC18.2 (C-21)、δH0.94 (d,J= 6.7 Hz)與δC17.5 (C-27)；4個連氧次甲基信號，其碳氫化學(xué)位移分別為δH3.55與δC71.7、δH3.86與δC67.1、δH4.43與δC70.7、δH4.25與δC73.1；1個連氧亞甲基δH3.55 (dd,J= 10.3, 5.8 Hz)/3.66 (dd,J= 10.2, 6.9 Hz)與δC67.8；1個連氧季碳δC76.7。以上特征數(shù)據(jù)表明，化合物4是一個多羥基甾醇類化合物。通過比對化合物4和化合物3的碳氫數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)這兩個化合物具有相似的化學(xué)機構(gòu)，不同點在于化合物4的結(jié)構(gòu)中少了一個次甲基(δH1.92與δC31.3)，而多了一個連氧季碳(δC76.7)。以上信息表明化合物4是化合物3的羥基取代產(chǎn)物，2D NMR分析表明羥基取代于C-8位，由生源途徑分析推測8-OH為β構(gòu)型。綜上所述，確定化合物4的結(jié)構(gòu)為(25S)-膽甾-3β,6α,8β,15β,16β,26-六醇，其波譜數(shù)據(jù)與文獻中報道的已知化合物一致[15]。

3 討論

海洋是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng)，其中的海洋生物孕育了大量具有特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)和多樣生物活性的物質(zhì)。然而，目前對海洋生物資源的開發(fā)利用仍十分有限。中華疣海星是中國的特有海洋生物品種，在中國南海分布廣泛，種群數(shù)量巨大，亟待開發(fā)。本文運用色譜分離技術(shù)和波譜解析技術(shù)從中華疣海星中分離鑒定了4個多羥基甾醇類化合物，均為首次從該屬海星中分離得到，從而為中華疣海星成分多樣性提供了實驗數(shù)據(jù)支持。后續(xù)將開展該動物化學(xué)成分藥理活性方面的研究，為其資源的進一步開發(fā)提供充足的科學(xué)依據(jù)。