重樓皂苷I對膠質瘤細胞增殖和遷移的影響

王媛媛 邱鵬程 杜洋 鄭淑嫻 薛玉葉 孫光強 陸云陽 湯海峰

腦膠質瘤起源于神經膠質細胞，是最常見的顱內腫瘤之一，其特征在于快速生長和高侵襲性[1]，年發病率約為(3～6.4)/10萬[2]。世界衛生組織分類系統根據惡性程度將其分為I～IV級，屬于惡性級別較高的為III～IV級[3-4]。由于膠質瘤浸潤性生長及高復發率的臨床特征，在采用手術切除后放療聯合替莫唑胺化療等多種治療手段下仍預后不佳，因此迫切需要尋找新的抗膠質瘤藥物[5-7]。

重樓皂苷I(polyphyllin I，PPI)(C44H70O16，又稱重樓皂苷D)是中藥重樓的主要成分之一，也是中國藥典(2020版)規定的重樓含量檢測成分之一。重樓皂苷藥理作用有抗菌、抗炎、止血、抗腫瘤等，其中抗腫瘤作用得到了較深入的研究[8]，表明它們對膀胱癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺腺癌等多種腫瘤細胞的生長有顯著抑制作用[9-11]。已有研究證實重樓皂苷I(D)對膠質瘤具有顯著抑制作用，如：重樓皂苷D通過Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路誘導U87人腦膠質瘤細胞凋亡[12]；重樓皂苷I通過JNK途徑誘導膠質瘤細胞U251凋亡以及阻滯細胞周期[13]；通過分子對接模擬PPI與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的結合方式及作用模式，從而驗證PPI直接靶向STAT3抑制U251細胞增殖并誘導凋亡[14]；重樓皂苷D誘導Nb-69細胞凋亡，以及IMR-32和LA-N-2細胞壞死[15]。高級別膠質瘤具有高度侵襲性，其高度侵襲性表型限制了治療的效果[16-17]。抑制遷移對腫瘤的侵襲具有重要作用，但PPI對膠質瘤細胞的遷移作用尚未見報道。因此，本文在驗證PPI對膠質瘤U373和U251細胞凋亡的基礎上，進行PPI抑制膠質瘤細胞遷移的研究。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

膠質瘤U251細胞(目錄號：TCHu 58)購自中國科學院上海細胞庫，U373購自美國ATCC細胞庫，并經過STR鑒定。

1.2 儀器

超凈工作臺(Thermo Fisher)，CO2恒溫培養箱(ESCO公司)，IX83倒置顯微鏡(Olympus)，血球計數板(上海市求精生化試劑儀器有限公司)，Multiskan FC 酶標儀(賽默飛公司)，流式細胞儀(BD FACSCalibur)，電泳系統(Bio-Rad)，凝膠成像系統(Bio-Rad)，超純水系統(Heal公司，NW10LVF)，超速冷凍離心機(湖南湘儀公司)。

1.3 試藥

重樓皂苷I(寶雞翊瑞生物科技有限公司，純度≥98%，批號：AF20052303)，細胞活力檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)(Elabscience，貨號：E-CK-A362)，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(BD，貨號：556547)，全蛋白提取試劑盒(凱基生物，貨號：KGP250)，DMEM培養基(Gibco，貨號：11965092)，胎牛血清(Biological Industries，貨號：04-121-1A)，胰蛋白酶(Solarbio，貨號：T1300)，青鏈霉素混合液(Solarbio，貨號：P1400)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(Elabscience，貨號：E-BC-K318-M)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天，貨號：P0012A)；Transwell小室(NEST，批號：040922ES010410A)；切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved Caspase-3)抗體(Wanleibio，批號：M12231992)、細胞色素C(Cytochrome-C，Cyt-C)抗體(Proteintech，貨號：10993-1-AP)、上皮鈣黏素(E-cadherin，E-cad)抗體(Servicebio，貨號：GB11868)、白細胞抑制因子2(drosophila mothers against decapentaplegic 2，Smad2)抗體(Servicebio，貨號：GB11511)；β-肌動蛋白(β-actin)抗體(Proteintech，貨號：20536-1-AP)；轉化生長因子-β受體1(Transforming Growth Factor Beta Receptor 1 ，TGF-β R1)抗體(Servicebio公司，貨號：GB11271)；其他試劑均為分析純。

1.4 細胞培養

將U373和U251細胞培養于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養基中，置于37℃、5% CO2細胞培養箱中，取處于對數生長期且狀態良好的細胞用于后續實驗。

1.5 CCK-8檢測細胞活力

取生長狀態良好且處于對數生長期的膠質瘤U373和U251細胞，鋪于96孔板，1×104個/孔，每孔加入100 μL完全培養基，置于37℃、5% CO2培養箱中，待細胞生長密度約為 80%時使用，PPI以濃度梯度(0.25、0.5、1、2、4、8、16和32 μM)處理24小時，每個劑量設置3個復孔。24小時后每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育培養2小時。用酶標儀在450 nm波長下測量各孔的光密度(oplical density，OD)值，計算細胞抑制率和藥物的半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)，每組實驗重復三次。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

取對數生長期的U373和U251細胞，接種到6孔板中，2.5×105個/孔。待細胞完全貼壁后，以不同劑量PPI(0、3、6 μM)處理24小時。收集細胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明進行細胞凋亡雙染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，每組實驗重復三次。

1.7 細胞劃痕創口愈合實驗

取對數生長期的U373和U251細胞，接種到12孔板中，1×105個/孔。待細胞生長融合至80%時，用10 μL移液器的槍頭在每個孔的中心垂直劃線，用PBS洗滌2次，洗掉劃痕處漂浮細胞，用不同劑量的PPI(0、1.5、3 μM)處理細胞，用倒置顯微鏡在不同時間點拍照(0、24小時)，觀察劃痕處愈合程度，每組實驗隨機拍照觀察三次。

1.8 Transwell遷移實驗

取對數生長期的U373和U251細胞，用無血清培養基重懸細胞，以每孔5×104個(200 μL)細胞懸液接種到Transwell上室中，下室加入700 μL有血清DMEM培養基，同時分別用不同劑量的PPI(0、3和6 μM)進行處理，在細胞培養箱中培養24小時后，取出小室，PBS輕輕清洗2次，用棉簽輕輕擦去上室面細胞，將小室下表面放在95%乙醇中固定30分鐘，用0.1%結晶紫染色20分鐘，隨機視野倒置顯微鏡下觀察拍照，每組實驗重復三次。

1.9 Western blot檢測相關蛋白

將處于對數生長期的U373和U251細胞中加入不同劑量的PPI(0、3和 6 μM )處理24小時， PBS緩沖液清洗，胰酶消化后離心，預冷PBS清洗兩次，加入100 μL Lysis Buffer 裂解液(按照1 mL冷Lysis Buffer加入10 μL磷酸酶抑制劑、1 μL蛋白酶抑制劑和5 μL 100 mM PMSF比例配制裂解液)，輕輕吹打混勻后置于冰上裂解30分鐘，4℃、12000 rpm離心15分鐘，收集上清液。各取20 μL上清液進行蛋白定量，按蛋白定量后的其余蛋白樣品的四分之一體積計算所需5× Loading Buffer緩沖液，并加入原始蛋白樣品中混勻。置于99℃加熱10分鐘使蛋白變性，即為制好的蛋白樣品，可放置于-80℃保存。電泳時制備5%濃縮膠，8%分離膠，每孔上樣量為5 μL，80 V跑至分離膠4/5處停止，PVDF膜標記并用甲醇活化后貼于膠面再于200 mA轉膜100分鐘，5%脫脂奶粉封閉1～2小時，PBST清洗，一抗4℃孵育過夜。根據一抗種屬選擇相應的二抗，搖床室溫孵育1小時后，用PBST清洗條帶6次，加入顯色液使用凝膠成像系統進行發光顯色，實驗重復3次。

1.10 統計分析

2 結果

2.1 PPI抑制膠質瘤U373和U251細胞增殖

給予梯度濃度PPI處理24 小時后，CCK-8實驗表明PPI對膠質瘤U373、U251細胞的增殖具有抑制作用，并顯現出劑量依賴性。經GraphPad Prism 8.0計算IC50，得出PPI對U373和U251的 IC50值分別為3.473 μM和2.52 μM(見圖1、表1和表2)。

圖1 PPI劑量依賴性抑制膠質瘤U373和U251細胞增殖

表1 CCK-8法分析PPI對膠質瘤U373細胞抑制率的影響

表2 CCK-8法分析PPI對膠質瘤U251細胞抑制率的影響

2.2 PPI誘導膠質瘤U373和U251細胞凋亡

流式細胞術結果顯示，加藥24小時后與對照組相比，隨著PPI給藥濃度的增大膠質瘤U373和U251細胞凋亡率增加，具有明顯的濃度依賴性(見圖2、表3和表4)。

表3 流式細胞術檢測PPI對膠質瘤細胞U373凋亡率的影響

表4 流式細胞術檢測PPI對膠質瘤細胞U251凋亡率的影響

注： B1壞死細胞；B2晚期凋亡細胞；B3未發生調亡的細胞；B4早期調亡。細胞凋亡率：B2與B4百分率之和。

2.3 PPI抑制膠質瘤U373和U251細胞遷移

細胞劃痕實驗表明，PPI不同劑量(0、1.5、3 μM)給藥U373和U251細胞后，劃痕愈合程度小于空白對照組(見圖3、表5和表6)；Transwell小室實驗表明，隨著PPI給藥濃度的增加，遷移的細胞數量減少，說明PPI劑量依賴性抑制膠質瘤細胞遷移(見圖4、表7和表8)。

表5 PPI對膠質瘤細胞U373劃痕愈合率的影響

表6 PPI對膠質瘤細胞U251劃痕愈合率的影響

表7 PPI對膠質瘤細胞U373遷移個數的影響

圖3 PPI給藥1.5 μM和3 μM劑量24小時抑制U373和U251細胞劃痕創口愈合(×100)

圖4 PPI給藥3 μM和6 μM劑量抑制U373和U251細胞遷移(×100)

表8 PPI對膠質瘤細胞U251遷移個數的影響

2.4 PPI對膠質瘤U373和U251細胞凋亡、遷移相關蛋白表達的影響

Western blot結果表明，PPI上調凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3和Cytochrome c的表達(見圖5和表9)，下調遷移相關蛋白TGF-β R1和Smad2的表達、上調E-cadherin的表達(見圖6和表10)。

圖5 PPI上調U373和U251細胞凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3和Cytochrome c的表達

3 討論

神經膠質瘤是最常見的顱內腫瘤之一，具有四高一低的特點，即高發病率、高復發率、高死亡率、高致殘率和低治愈率。目前臨床上神經外科手術是膠質瘤的最佳和最直接的治療方法，但因其浸潤性生長且邊緣不清，導致手術難以全部切除，易留下瘤根，導致復發可能性，所以術后化療是不可缺少的治療手段[18]。當前一線化療藥物為替莫唑胺，但治療效果和患者生存質量尚不理想[19]。因此，尋找和開發更有效的藥物來治療膠質瘤迫在眉睫。

圖6 PPI下調遷移相關蛋白TGF-β R1和Smad2、

以往對重樓皂苷I的研究主要為誘導膠質瘤細胞凋亡，尚未涉及影響膠質瘤浸潤性生長的相關研究。Yu Q等[12]發現重樓皂苷D可通過調節JNK的表達來介導凋亡；LIU J等[13]通過驗證得出PPI能夠抑制U251細胞的生長，并誘導人膠質瘤U251細胞的G2/M期阻滯和凋亡。鄭彬[20]的研究表明PPI可以誘導膠質瘤U251細胞凋亡，作用機制除可能與細胞線粒體凋亡途徑的信號轉導過程有關。以上研究表明PPI誘導膠質瘤細胞凋亡涉及多通路、多機制。

表9 PPI對膠質瘤細胞U373和U251中凋亡相關蛋白的影響

表10 PPI對膠質瘤細胞U373和U251中遷移相關蛋白的影響

有研究表明，皂苷類成分可誘導腫瘤細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生增加，導致線粒體膜電位崩潰，伴隨細胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)從胞漿的釋放，從而激活半胱天冬酶(caspase)途徑，誘導線粒體途徑凋亡[21-22]。Cyt C從線粒體釋放到細胞質基質是細胞凋亡的一組主要驅動因素，Cleaved Caspase-3為天冬酰胺特異酶切的半胱氨酸蛋白酶，能夠破壞細胞功能，在細胞凋亡的早期階段發揮著關鍵性的作用[23]。Cyt C從線粒體轉移到細胞質基質，還可激活切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(Cleaved Caspase-9)，并進一步導致Cleaved Caspase-3的激活[24]。以往對PPI誘導膠質瘤細胞凋亡機制研究的報道中未涉及Cleaved Caspase-3的作用。本實驗采用流式細胞術檢測細胞凋亡，結果顯示隨著PPI給藥濃度的增大細胞凋亡率亦增加；Western blot結果表明PPI上調凋亡相關蛋白Cyt C和Cleaved Caspase-3的表達，表明PPI通過上述線粒體途徑誘導了膠質瘤U373和U251細胞凋亡。

膠質瘤出現侵襲性增強以及腫瘤容易復發，與上皮—間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的發生是密切相關的，最顯著的特征包括細胞喪失極性和粘附性，并增加侵襲和遷移能力[25]。上皮鈣黏素E-cadherin、TGF-β R1和Smad2均對EMT具有重要作用。E-cadherin屬于跨膜糖蛋白家族，負責鈣依賴性細胞間粘附。EMT的一個標志性事件是E-cadherin表達的減弱或缺失，從而介導惡性腫瘤細胞遷移和侵襲[26]。TGF-β/Smad信號通路參與細胞生長、分化和細胞穩態等生理過程，在EMT的經典信號通路中，TGF-β R1可激活Smad2進而促進細胞遷移[27-29]。TGF-β R1信號的下調被認為可以防止腫瘤細胞中的EMT[30-32]。本實驗通過劃痕創口愈合實驗與Transwell小室實驗首次證明PPI可降低膠質瘤細胞遷移的能力，Western blot表明分子機制涉及下調遷移相關蛋白TGF-β R1和Smad2，上調E-cadherin的表達。

本文在驗證了PPI能夠抑制膠質瘤U373和U251細胞增殖、促進其凋亡的基礎上，首次發現PPI可抑制膠質瘤細胞遷移，從而使得對PPI抗膠質瘤作用機制有了更深入的理解，也為PPI抗膠質瘤作用今后的新藥開發及臨床應用提供了新的實驗依據。