艾灸對慶大霉素致聽力損傷豚鼠模型的干預效應及其作用機制

崔靜文 胡慧

突發性耳聾也稱急性特發性感音神經性聽力損失或特發性突聾，72小時內突然發生的、原因不明的感音神經性聽力損失，至少在相鄰的兩個頻率聽力下降≥20 dBHL。該病是耳鼻喉科常見病和疑難病之一，其病因病機錯綜復雜，研究認為突發性耳聾的主要病因學說有病毒感染、藥物影響、應激反應和免疫因素等學說[1]。耳蝸血管因其特殊的解剖結構，當受到各種原因影響出現微循環障礙時，局部就會蓄積大量自由基，當其超過耳蝸中抗氧化酶的清除作用時，即可造成毛細胞的損傷改變或壞死，造成聽力下降[2]。慶大霉素的耳毒性造成傷害的途徑主要來自于活性氧的生成，活性氧在內耳造成一系列反應，被認為是最早的事件，最終引起毛細胞的凋亡[3]。本研究以慶大霉素耳毒性造成豚鼠聽力損傷模型，旨在探究艾灸對于慶大霉素耳毒性造成的豚鼠模型是否具有清除氧自由基，改善微循環，抑制細胞凋亡的功能，以探究其在治療突發性耳聾中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用耳廓反射靈敏的白色紅目健康豚鼠18只，雄性，體質量250～350 g，耳廓聲音反射靈敏，無噪音暴露史及藥物使用史。豚鼠飼養于北京中醫藥大學東方醫院動物房，標準飼料養于清潔級環境中，室溫22～26℃，實驗前適應性飼養一周。豚鼠購自北京為通利華公司，動物批號：No.110011201110102486。經實驗動物倫理委員會倫理審查許可。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要儀器 腦干誘發電位儀(首都醫科大學耳鼻喉科研實驗室提供)，顯微手術器械，解剖顯微鏡，超凈工作臺，-80℃低溫冰箱，臺式高速冷凍離心機(THERMO)。

1.2.2 主要試劑 硫酸慶大霉素粉劑，戊巴比妥鈉，蒸餾水，9%氯化鈉注射液，10%中性福爾馬林固定液，0.5%伊紅乙醇染色液，中性樹膠，95%乙醇，無水乙醇等。

1.2.3 實驗耗材 自制豚鼠固定袋，1 mL一次性注射器，5 mL 一次性注射器，棉簽，5 mL、10 mL、50 mL EP 管，燒杯50 mL，鑷子，止血鉗，剪刀，移液管，移液槍，組織剪，安瓿瓶，液氮，記號筆，豚鼠鼠料，豚鼠墊料等。

1.3 動物分組、造模與干預方法

18只豚鼠適應性分籠飼養一周后，隨機分為3組，即慶大霉素組、慶大霉素+艾灸組和生理鹽水組。干預方法見表1，具體如下：慶大霉素組腹腔注射硫酸慶大霉素120 mg/(kg·d)，連續14天；慶大霉素+艾灸組肌注硫酸慶大霉素120 mg/(kg·d)，注射后立即予艾灸治療15分鐘1次/天，將豚鼠固定后暴露雙耳外耳道，采用“百笑灸”固定于外耳道口，艾灸燃燒期間距離外耳道口約2～4 cm，艾灸15分鐘，連續14天；生理鹽水組腹腔注射9%的生理鹽水2.4 mL/(kg·d)，連續14天。整個過程中避免接觸噪聲，每兩天測量豚鼠體重以調整藥量并嚴密觀察豚鼠的毛發、食量、排泄物和活動度等變化。

表1 各組豚鼠干預方法

1.4 指標檢測

1.4.1 Click聽性腦干反應檢測 所有干預結束后一天，進行Click聽性腦干反應檢測。采用2%戊巴比妥鈉麻醉劑，腹腔注射式麻醉，麻醉前稱量各組豚鼠體重，按照3 mg/100 g進行麻醉，麻醉時豚鼠頭低腳高位抓取，腹部朝上，于豚鼠腹部腹白線兩側呈30度進針，刺入腹肌，進入腹膜腔，有落空感時，需進行針管回抽，確定未刺入腹腔臟器血管后，注射麻醉劑。將已進入深度麻醉后的豚鼠移入電磁屏蔽箱內，對豚鼠進行ABR閾值檢測在隔音屏蔽室內進行測試，記錄電極插入顱頂正中皮下，參考與接地電極分別插人同側與對側耳后，耳機插入耳外耳道口約0.5 cm，刺激聲為交替短聲(click)，重復率16次/秒，平均疊加500次，測試從90 dB強度依次以10 dB向下減弱，觀測Ⅲ波的引出最小刺激強度為閾(因為實驗中Ⅲ波最明顯)，記錄各組豚鼠ABR閾值。測聽室內保持黑暗并緊關隔聲門以減少外界干擾。

1.4.2 血清一氧化氮(nitric oxide, NO)、內皮素(endothelin, ET)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol, CHDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL-C)檢測 三組共18只豚鼠，ABR實驗結束后，腹主動脈取血處死豚鼠，將全血標本在室溫放置2小時，然后1000 g離心20分鐘，取上清，使用前將血清緩慢均衡至室溫(18～25°C)，血清標本推薦稀釋大約50倍，取10 μL血清加入490 μL PBS。標本使用0.01 mol/L的PBS稀釋(PH=7.0～7.2)。 應用相關試劑盒(試劑盒由南京建成生物工程研究所提供) 分別測定豚鼠血清中NO、ET、TG、CHDL、LDL-C的含量，操作規程嚴格按照說明書進行。

1.4.3 耳蝸氧化指標SOD/MDA檢測 三組共18只豚鼠，在腹主動脈取血后，斷頭，暴露出右側聽泡迅速打開，在解剖顯微鏡下剝離耳蝸，并將耳蝸迅速放入液氮中進行冷凍，冷凍30分鐘左右，隨后取出耳蝸以研缽將其研磨至碎片，取適量待測研磨好的耳蝸碎片，加入生理鹽水，用分散機將耳蝸組織進行勻漿2分鐘，將勻漿移入10 mL EP管中，4000 rpm離心15分鐘后用移液槍提取上清液，保存在-80℃冰箱以待后續實驗使用。整個操作過程要保持耳蝸組織在冰水混合物中以保證后續檢測指標活性。 應用相關試劑盒 (試劑盒由南京建成生物工程研究所提供) 分別測定耳蝸組織中超氧化物歧化酶(supper oxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondial dehyde, MDA)的含量，操作規程嚴格按照說明書進行。

1.4.4 Pcr計量耳蝸BAX、BCL2轉錄表達水平 三組共18只豚鼠，取適量待測研磨好的右側耳蝸碎片，按說明書記載提取樣品總RNA，進行總RNA質量檢測，逆轉錄合成cDNA，實時熒光定量檢測。

1.4.5 耳蝸螺旋韌帶血管紋鋪片 三組豚鼠各取2只左側耳蝸用于耳蝸血管紋鋪片，主要方法是將琥珀酸鈉(0.2 mol/L)、磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L)、氯化硝基四氮唑藍(0.1%)配置成琥珀酸脫氫酶染色液，待用。斷頭后，將豚鼠蝸尖鉆孔并摘除鐙骨，打開園窗，將琥珀酸脫氫酶染色液灌入耳蝸，在37℃恒溫箱內作用40～60分鐘，再將耳蝸浸入10%中性福爾馬林固定液，固定時間為24小時，常規脫鈣，分離取出全耳蝸基底膜，移入載玻片上的甘油滴中，蓋上蓋玻片，中性樹膠封固。用微細分離針取耳蝸第三轉外側壁螺旋韌帶，移入載玻片樹脂滴中，鋪片，螺旋韌帶一面朝上，封片，觀察并拍照。

1.4.6 免疫熒光染色方法 檢測耳蝸血管紋附近血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達 三組豚鼠各取4只左側耳蝸用于檢測VEGF表達，將耳蝸剝離血管紋，鋪片，脫蠟、水化、PBS洗5分鐘3次，而后以3.3%過氧化氫分化10分鐘，再次PBS洗5分鐘3次，滴加10%牛血清阻斷非特異性抗體20分鐘，滴加VEGF多克隆抗體(1∶100)37℃1小時，PBS洗5分鐘三次，FITC標記二抗(1∶50)37℃ 1小時。PBS洗5分鐘三次。熒光染色物鏡讀片，拍照。

1.5 數據處理

2 結果

2.1 干預后各組豚鼠clickABR閾值比較

與空白組比較，慶大霉素組與慶大霉素+艾灸組豚鼠的平均聽閾值明顯升高(P<0.05)。與慶大霉素組比較，慶大霉素+艾灸組聽力閾值明顯降低(P<0.05)。結果見表2。

表2 各組豚鼠平均聽閾值

2.2 耳蝸螺旋韌帶血管紋觀察

空白組螺旋韌帶血管紋顯示基本正常，粗細均勻順暢；慶大霉素組可見耳蝸螺旋韌帶血管紋屈曲變窄，血管粗細不均；慶大霉素+艾灸組可見耳蝸螺旋韌帶血管紋結構稍有不流暢，粗細稍顯不均。見圖1。

2.3 豚鼠耳蝸組織中MDA與SOD含量

結果顯示，與空白組相比，慶大霉素組與慶大霉素+艾灸組耳蝸組織MDA含量上升，SOD含量下降，差異比較有統計學意義(P<0.05)。與慶大霉素組相比，慶大霉素+艾灸組MDA含量下降，SOD含量上升，差異有統計學意義(P<0.05)。結果見表3。

注:A 空白組;B 慶大霉素組;C 慶大霉素+艾灸組

表3 各組豚鼠耳蝸組織SOD、MDA含量

2.4 豚鼠血清ET與NO水平

與空白組比較，慶大霉素組與慶大霉素+艾灸組血清ET含量升高，血清NO含量升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與慶大霉素組比較，慶大霉素+艾灸組血清ET含量降低，差異不具有統計學意義(P>0.05)，血清NO含量升高，差異有統計學意義(P<0.05)。結果見表4。

表4 各組豚鼠血清NO、ET含量

2.5 耳蝸Bcl-2/Bax蛋白基因轉錄水平

與空白組比較，慶大霉素組與慶大霉素+艾灸組耳蝸Bcl-2含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)，Bax含量慶大霉素組升高，慶大霉素+艾灸組降低，差異不具有統計學意義(P>0.05)，Bcl-2/Bax值降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與慶大霉素組相比，慶大霉素+艾灸組Bcl-2含量升高，差異不具有統計學意義(P>0.05)，Bax含量升高，差異有統計學意義(P<0.05),Bcl-2/Bax含量升高，差異有統計學意義(P<0.05)。結果見表5。

表5 各組豚鼠耳蝸Bcl-2/Bax基因轉錄水平

2.6 豚鼠血漿血脂水平檢測結果

與空白組比較，慶大霉素組TG含量降低，慶大霉素+艾灸組TG含量升高，差異不具有統計學意義(P>0.05)，CHDL含量降低，差異不具有統計學意義(P>0.05)，LDL-C含量降低，差異不具有統計學意義(P>0.05)；與慶大霉素組相比，慶大霉素+艾灸組TG含量升高，差異不具有統計學意義(P>0.05)，CHDL含量降低，差異不具有統計學意義(P>0.05)，LDL-C含量降低，差異不具有統計學意義(P>0.05)。結果見表6。

表6 三組豚鼠血漿血脂水平

2.7 耳蝸血管紋附近VEGF分布

免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察發現，各組圖片VEGF(綠色)顯色均呈陽性，分布范圍較廣，與上皮細胞分布范圍基本重合，圖片中可見明顯管腔結構陰影。與空白對照組相比，慶大霉素組耳蝸血管紋周圍組織VEGF蛋白(綠色)熒光強度稍有增強，并可見管腔狀結構；慶大霉素+艾灸組熒光強度比空白組稍有增強，在管腔結構附近熒光強度增加明顯，血管內皮附近熒光強度增強最為明顯。見圖2。

注:A：空白組；B:慶大霉素組；C:慶大霉素+艾灸組

3 討論

突發性耳聾病因復雜，內耳微循環障礙是突發性耳聾的常見原因，也是最主要的原因，是內耳血管解剖結構與其他致病因素共同影響下的現象產物。各種病理、生理狀態下的血液流變學改變均可引起耳蝸微循環障礙，導致局部缺血缺氧，使得內耳神經細胞損傷凋亡是導致突發的聽力下降的重要原因[2]。突發性耳聾的病因尚不明確，可能與藥物耳毒性，遺傳因素，情緒因素等諸多因素相關，通過對這些病因進行歸納總結，發現其中血管內皮損傷，微循環障礙，毛細胞凋亡是作為各種原因影響聽力下降的共同重要途經[4]，與微循環障礙，氧化應激反應關系較為密切的指標有反應過氧化物損傷程度的SOD/MDA，調節血管形態的活性因子NO/ET，與血管內皮損傷密切相關的VEGF，而過氧化反應最終損傷線粒體DNA，導致凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達異常，Bcl-2/Bax凋亡軸可反應細胞凋亡的進程。目前關于突發性耳聾的治療主要以中西醫結合治療為主，關于艾灸等治療方法也有報道，如范新華等[5]采用針刺結合艾灸治療突發性耳聾，采用局部配合遠端取穴的方法，強調遠端取穴的重要性的同時選取局部的聽宮、聽會、耳門穴，治療總有效率可達80%。艾葉本身的化學成分具有抗炎，抗血凝，抗氧化等多種功效[6]，其燃燒所產生的物理效能可以發揮其火熱之力，溫熱藥性，可直接作用于血液系統，優化血液成分，還能促進微循環和組織深部的血流灌注[7]作用在局部具有疏通經絡，活血化瘀的作用。且成本低廉，操作方便，有較高的臨床應用價值。而對于艾灸療法在突發性耳聾中的作用機制目前仍缺乏深入研究。

慶大霉素是則是最有代表性的氨基糖苷類抗生素之一，但它的耳毒性可以給患者帶來不可逆的聽力損傷。氨基糖苷類抗生素也是耳聾的動物模型最常用的造模方法之一，它所造成傷害的途徑主要來自于活性氧的生成，引發脂質過氧化反應從而造成對耳蝸毛細胞、支持細胞等的損傷，在內耳一系列的反應中被認為是最早的事件在毛細胞死亡過程中起關鍵作用[8-9]。王愛梅等[10]的研究顯示，慶大霉素處理后，可以使得耳蝸組織中超氧化物歧化酶活性降低，而使脂質氧化物的代謝產物MDA含量增加，證實了慶大霉素可以提高發生在內耳的氧化應激反應，加重過氧化損傷。李明等[11]對氨基糖普類抗生素耳毒性方面的機制研究發現，慶大霉素對耳蝸的損傷包括藥物在耳蝸內的聚集，螺旋神經節血管紋組織細胞抗氧化機制的激活，耳蝸螺旋神經節和毛細胞的凋亡等。慶大霉素所造成的耳毒性與氧化應激損傷有明顯相關性，這與突發性耳聾的病機密切相關，而慶大霉素產生耳毒性的時間和效果更穩定，給了艾灸發揮治療效果的空間。

SOD與MDA是一組反應氧化應激損傷的重要指標，也是反應耳蝸局部微循環障礙嚴重程度的重要因子，微循環障礙的發生會導致耳蝸局部血液供應減少，缺血缺氧，使得過氧化物產物局部蓄積[12-13]，結果顯示，慶大霉素導致了過氧化產物在耳內的蓄積，導致耳蝸內SOD下降，MDA上升，造成內耳的過氧化損傷，艾灸干預可以上調SOD含量，下調MDA含量，從而減少自由基對細胞膜及線粒體的損傷。NO/ET是一組調節血管舒張收縮功能的活性因子，有研究表明機體在缺血、缺氧等情況下，血管內皮受到刺激可釋放大量內皮素，進而收縮血管加重突發性耳聾中的微循環障礙及缺血缺氧[14]，同時NO還是一種氧自由基清除劑。慶大霉素干預使得豚鼠血漿內皮素ET含量增加，血管收縮，而艾灸的干預明顯上調了NO的含量并下調ET的含量，雖然對于ET的下調并不顯著，仍可以看出艾灸使得血管擴張，并增加了清除氧自由基的能力，改善局部缺氧；而從病理表現來看，慶大霉素組可見耳蝸螺旋韌帶血管紋屈曲變窄，而慶大霉素+艾灸組的血管明顯比慶大霉素組更加粗和流暢，直觀地說明了艾灸可以擴張血管，增加局部的血液供應量，改善微循環障礙。

突發性耳聾聽力下降的根本原因，是缺血缺氧會導致內耳毛細胞損傷及凋亡。研究表明活性氧的蓄積可改變線粒體通透性, 使自由基以及凋亡相關物質進入細胞質,造成線粒體DNA的氧化損傷, 誘導細胞凋亡基因的表達。而MDA的增加也會導致線粒體膜流動性下降, 使得依賴線粒體膜流動性的Ca2+-ATP酶活性下降, 導致細胞內Ca2+增加, 最終Ca2+超載造成細胞凋亡[15]。Narrima等[16]和TIAN等[17]的實驗均證實, 細胞產生的氧化應激反應會導致Bax增多，Bcl-2減少, 最終細胞凋亡。Bcl-2和Bax是一對凋亡相關蛋白，是抑制或促進細胞凋亡過程中重要的分子，其促進或抑制細胞凋亡的機制己被研究清楚[18]，Bcl-2是一種抗凋亡因子主要通過抑制Ca2+內流，穩定線粒體膜，抑制線粒體內的凋亡相關蛋白釋放，來達到控制細胞凋亡的目的[19]。此外，Bcl-2還可以抑制活性氧對細胞膜的損害，對細胞起到保護作用[20-21]。Bax是促進細胞凋亡的因子，可以破壞線粒體膜的完整性，并與Bcl-2等抑制凋亡的蛋白對抗，阻止其發揮抗凋亡作用。Bcl-2/Bax凋亡軸的偏倚決定了細胞是否會進入凋亡程序[22-23]。本次研究發現，慶大霉素使得耳蝸內細胞凋亡因子BCL2/BAX的升高，而艾灸的干預下調了BCL-2/BAX的表達水平，說明艾灸可以抑制細胞凋亡的發生，并起到預方保護聽力的作用。與聽力表現結果相符。

VEGF是增加微血管通透性的主要調節因子。最新研究認為,缺血缺氧為導致VEGF過度表達的重要因素，通過缺氧誘導因子可上調VEGF的表達[24]。而在缺血缺氧發生時，VEGF可對神經系統具有多重保護作用,包括血管形成、神經營養和神經保護作用及抗凋亡等多種機制[25-27]。本研究中，利用免疫熒光法檢測分析發現，正常生理條件下VEGF的表達范圍基本與內皮細胞所在范圍重合，分布較為廣泛，顯色較暗，而與空白組相比，經慶大霉素干預后豚鼠耳蝸血管紋周圍組織VEGF蛋白(綠色)熒光強度略有增強，血管壁附近熒光強度增強不明顯。而對于慶大霉素+艾灸組而言，血管紋周圍組織VEGF蛋白(綠色)熒光強度比空白組稍有增強，且血管內皮附近熒光強度升高明顯。本實驗說明艾灸可以上調VEGF蛋白表達的增加，主要作用于血管內皮細胞，可改善血管通透性，防止血栓形成，并影響內皮細胞的分泌功能，進而對局部血液成分產生影響，可能為其治療突發性聾的機制之一。

而血脂水平三組豚鼠均無顯著差異，說明慶大霉素的耳毒性與血脂代謝無明顯相關性，以慶大霉素干預造成豚鼠聽力損傷的模型造模時間較短，不能體現出對于代謝水平的影響，而艾灸對于脂代謝具有雙向調節作用，因而在慶大霉素造模的豚鼠模型中無顯著效果。

本研究結果表明，慶大霉素的耳毒性可引起內耳氧化應激反應，SOD降低MDA升高，氧自由基的蓄積與對細胞膜的損傷可影響血管內皮的分泌，使得NO水平升高，ET含量降低，造成血管調控功能異常，加重微循環障礙，進一步加重氧化應激損傷，且低氧環境可以誘導VEGF的表達，還可通過損傷線粒體DNA，引起細胞凋亡因子BCL2/BAX的升高，進而導致毛細胞損傷凋亡，聽力損傷。艾灸可以增加血管內皮上附著的VEGF的含量，增強血管通透性，增加局部血容量，并且艾灸可以導致SOD下調減輕，MDA上調減輕，減少了耳蝸局部氧自由基的含量，下調細胞凋亡因子BCL2/BAX的水平，最終起到保護細胞免于凋亡的作用。說明艾灸改善聽力的作用可能與其活血化瘀與抗氧化的性質有關，局部艾灸可以起到擴張血管，并且提高機體清除自由基的能力，保護耳蝸組織細胞和神經的功能。但本研究尚未發現艾灸的溫熱效應是否存在副反應，及對于不同證型的耳聾是否具有相同的效果，有待后續深入研究。