葛根及含葛根復方對重癥肌無力大鼠骨骼肌及線粒體動力相關蛋白1的影響

彭高強 文穎娟 陳茉 仝武寧

重癥肌無力(myasthenia gravis, MG)是一種影響骨骼肌神經肌肉接頭的自身免疫性疾病，其特征為波動性肌無力，常累及眼肌、咽喉及四肢，具有晨輕暮重，活動后加重，休息時減輕，可發生于全身各個骨骼肌的特點[1]。目前治療MG沒有特效藥，一般采取對癥治療，如膽堿酯酶抑制劑、免疫抑制治療等。

中醫無重癥肌無力這一說法，但根據其主要表現為肢肉活動無力而將其納入“痿癥”范疇。主要是由于脾虛或痰濕瘀血等濁邪阻滯中焦，導致脾不能輸布散津至四肢肌肉而表現出四肢肌肉收縮無力或偏廢不用的臨床癥狀，以脾虛為本，濁邪阻滯為標，病機總屬于虛實夾雜[2-3]。動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1, Drp1)是調控線粒體分裂的一種蛋白，對線粒體分裂起主要作用，線粒體分裂增加會使網狀結構發生改變，線粒體片段化增多、細胞內Ca2+紊亂以及活性氧的大量產生從而導致線粒體的損傷[4-5]，研究表明，抑制大鼠骨骼肌中線粒體Drp1蛋白表達，可以減少線粒體的過度分裂，從而對線粒體功能的改善，骨骼肌收縮能力有一定的積極作用[6]，前期實驗研究表明葛根及其復方能夠改善重癥肌無力大鼠骨骼肌肌力及線粒體功能[3, 7]。在此基礎上，本實驗觀察葛根及其復方對實驗性自身免疫性重癥肌無力大鼠骨骼肌組織及線粒體Drp1蛋白影響，以進一步明確葛根治療MG的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

80只SPF級Lewis大鼠，雌性，體質量為(160～180)g，精神狀況良好，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK(川)2020-030。本實驗通過陜西中醫藥大學倫理審查，動物倫理編號：SUCM-DL20210621001。

1.2 實驗處方與藥物

葛根方：葛根20 g；葛芪方：黃芪15 g、葛根20 g；葛參方： 丹參15 g 、葛根20 g；葛妙方：牛膝15 g、黃柏15 g、薏苡仁15 g、蒼術15 g、葛根20 g；葛芪參妙方：牛膝15 g、黃柏15 g、薏苡仁15 g、黃芪15 g、蒼術15 g、葛根20 g。中藥飲片由陜西中醫藥大學校醫院提供。陽性對照組藥物：強的松龍(由天津藥業集團新鄭股份有限公司提供)。

1.3 實驗試劑

鼠源性AchR-α亞基97-116肽段序列(貨號：C8385FE270-1，金斯瑞生物科技股份有限公司)、2.5%磷酸鹽緩沖液(PBS，貨號：ZLI-9062，賽默飛世爾科技公司)、完全福氏劑(貨號：F5881)、不完全福氏劑(貨號：F5506，美國sigma公司)。一抗、二抗稀釋液(貨號：WB0158、WB0159)、蛋白定量試劑盒(貨號：WB2123)等均來自上海威奧公司。組織勻漿器、脫色搖床、全波長酶波儀等均由陜西中醫藥大學實驗室提供。

1.4 分組造模

大鼠購買后于陜西中醫藥大學動物房適應性飼養1周，然后隨機將大鼠分為空白組、模型組、葛芪組、葛參組、葛妙組、葛根組、葛芪參妙組、強的松組，共8組，每組各10只。進行造模，將肽段、PBS、完全福氏劑三者按照1∶1.5∶1.5的比例混合制成乳劑；取除空白組以外的大鼠，分別在其后足底、腹部、背部淺表組織注射入200 μL(含肽段100 μg)乳劑進行造模，用相同劑量的PBS注射空白組。30天后進行第二次免疫，將肽段、PBS、不完全福氏劑三者按照1∶3∶3的比例混合成免疫乳劑，再次皮下注射200 μL(含肽段50 μg)乳劑以強化免疫造模大鼠，空白組注射同量的PBS。

1.5 給藥方法

造模成功后，給予模型組、空白組生理鹽水灌胃，3 mL/次。葛根復方組與強的松組按照人鼠劑量公式換算，葛根組為2.08 g/(kg·d)，葛芪組3.65 g/(kg·d),葛參組3.65 g/(kg·d),葛妙組8.33 g/(kg·d)，葛芪參妙組11.46 g/(kg·d) ，強的松組給予5.4 mg/(kg·d)。每日灌胃1次，連續28天。

1.6 取材及檢測

1.6.1 蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)對骨骼肌組織的觀察 給藥28天后，禁食12小時，隨機從每組大鼠選取5只并給予大鼠腹腔麻醉，將大鼠處死，沿著坐骨神經走向分離出骨骼肌并將其切成小塊，然后使用固定液對組織進行固定，再經石蠟包埋將包埋好的骨骼肌組織進行病理切片(切片厚度為3 μm～4 μm)、脫水、染色、封片等步驟，再通過顯微鏡下觀察組織的變化。

1.6.2 透射電鏡觀察大鼠骨骼肌線粒體超微結構變化 將大鼠骨骼肌組織分成小塊，經PBS、四氧化鋨固定、梯度乙醇脫水、組織包埋后，于透射電鏡觀察下觀察線粒的超微結構。

1.6.3 蛋白印跡法檢測大鼠各組骨骼肌Drp1蛋白的表達 取大鼠各組骨骼肌組織剪切成細小的碎片，然后按每20 mg組織加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，經離心、電泳、轉膜、孵育后對Drp1蛋白進行顯影拍照并分析條帶的灰度值。

1.7 統計方法

2 結果

2.1 大鼠骨骼肌病理組織變化

由圖看出，空白組大鼠骨骼肌組織完整、無斷裂、無腫脹、細胞核排列整齊。較空白組而言模型組骨骼肌肌纖維排列紊亂有斷裂現象、細胞核排列不規則并有炎癥細胞浸潤。與模型組相比，藥物治療各組骨骼肌肌纖維紊亂斷裂以及緊密度現象都有一定程度改善，細胞核偏移、炎癥浸潤逐漸減少，其中以葛芪參妙組效果最優，見圖1。

2.2 電鏡下各組大鼠骨骼肌線粒體變化情況

由圖看出，空白組大鼠骨骼肌線粒體排列整齊，呈長橢圓形，線粒體與肌節平行，線粒體結構清晰可見。模型組大鼠骨骼肌線粒體出現腫脹變形，線粒體嵴斷裂、模糊不清甚至形成空泡。葛根組大鼠骨骼肌線粒體排列較整齊，部分線粒體有腫脹、變形、線粒體嵴紊亂及外膜破裂現象。葛芪組骨骼肌肌節較清晰，線粒體部分發生了腫脹、基質減少、外膜破壞及小范圍空泡的形成。葛參組肌纖維間隙增大、部分線粒體也出現了溶脹變大。葛妙組能夠觀察到線粒體形態被拉長、腫脹、溶解。葛芪參妙組線粒體總體排列整齊、線粒體膜結構完整、結構清晰，只有少量線粒體出現了腫脹。強的松組能夠觀察到骨骼肌肌纖維之間有明顯的間隙，肌節排列相對不平行，較多的線粒體出現了溶解、腫脹、嵴紊亂、基質減少。總而言之，和模型組相比，治療各組肌纖維緊密度、肌節平行度有所改善、線粒體腫脹程度、空泡化、嵴紊亂情況都有不同程度緩解，其中以葛芪參妙組恢復效果最優，見圖2。

注：A 空白組； B 模型組；C 葛根組；D 葛芪組；E 葛參組；F 葛妙組；G 葛芪參妙組；H 強的松組。

注：A 空白組； B 模型組；C 葛根組；D 葛芪組；E 葛參組；F 葛妙組；G 葛芪參妙組；H 強的松組。

2.3 各組小鼠骨骼肌線粒體Drp1蛋白的比較

圖3、表1結果顯示：空白組Drp1蛋白明顯低于其余各組骨骼肌中Drp1蛋白表達，差異具有統計意義(P<0.01)；與模型組相比，藥物干預組中Drp1蛋白有不同程度降低(P<0.05)，其中以葛妙、葛芪參妙組中Drp1蛋白表達降低幅度最大(P<0.01)，優于強的松組(P<0.01)，葛根組、葛芪組與強的松組組間無明顯差異(P>0.05)。表明了葛根復方能夠調節大鼠骨骼肌組織中線粒體Drp1蛋白表達。

表1 各組大鼠骨骼肌Drp1蛋白表達比較

圖3 各組大鼠線粒體Drp1蛋白表達情況

3 討論

中醫根據MG主要以四肢筋脈松弛無力，不能隨意運動或伴有肌肉萎縮的臨床表現將其納入“痿癥”范疇。中醫認為，脾主運化，為氣血生化之源，脾健則氣血等精微物質才能充養臟腑經絡、四肢百骸才能發揮正常的生理活動；脾虛會導致痰濕、瘀血不化，進而導致肌肉組織得不到精微物質濡養而出現肢體不用的情況，故普遍認為脾虛兼痰瘀濁邪內阻是MG發病的主要原因，其病機多為虛實夾雜[2-3]。《松峰說疫》云：“脾主肌肉，外應四肢，肌肉痿，行善瘈，腳下痛。脾太過則令四肢不舉。”由此為MG從脾治療提供了理論依據。雷孝文[8]觀察到通過益氣健脾法能夠有效改善重癥肌無力大鼠骨骼肌線粒體能量代謝，從而起到治療MG的作用。由此證明，脾虛引起骨骼和線粒體異常是MG發病重要原因。因此，本研究選取葛根為主藥藥物進行研究(葛根甘、辛，歸于脾胃經，具有祛邪和扶正作用，與MG發病機制相對應[9])，考慮到脾的功能減退不但容易使肌肉組織失去濡養還容易因運化無力導致氣血阻滯，痰瘀等病理產物堆積形成，進而導致MG在疾病的發展過程中形成“因虛致實、虛實夾雜”的局面。以往對MG的實驗多從補虛入手，少有從補虛瀉實法治療MG的實驗，故本實驗分別佐以健脾的黃芪、活血的丹參、清熱祛濕的四妙散，以觀察葛根復方對MG大鼠骨骼肌及線粒體的影響。由于Drp1蛋白在骨骼肌過度表達會使骨骼肌中線粒體能量代謝紊亂，導致肌肉質量、運動能力降低[10]。由此可以看出Drp1蛋白高表達可能跟肌肉受損存在著重要聯系。為此本實驗也對Drp1蛋白表達進行了檢測，本研究發現模型組骨骼肌組織及線粒體結構損傷、Drp1蛋白表達明顯高于空白組。總而言之，Drp1蛋白表達結果與病理組織及電鏡結果總體一致，但值得指出的是葛妙組中骨骼肌病理組織及線粒體結構恢復不及葛芪參妙組，而在蛋白印跡法檢測Drp1蛋白顯示二者并無明顯差異。出現這原因筆者分析可能有兩點：一是分裂蛋白Drp1表達開始下降，線粒體結構還尚未恢復；二是蛋白表達測量時可能存在一定的誤差。結合電鏡結果可以看出重癥肌無力會促使骨骼肌線粒體分裂從而引起線粒體質量受損，經葛根復方治療后線粒體結構有所好轉，Drp1蛋白表達量也逐漸下降并向空白組靠近，其中以葛芪參妙組最明顯，由此說明葛根復方可抑制Drp1蛋白表達、降低線粒體的分裂程度，促進線粒體質量的恢復。從中醫角度分析，葛根雖有扶正祛邪的功效，但藥物單一，故療效一般。而葛芪參妙組由葛根、黃芪、丹參、四妙散組成的復方，具有益氣活血、通絡祛濕作用，增強了葛根扶正祛邪的功效，更符合MG“虛實夾雜”的病因病機，所以療效更顯著。

綜上，本實驗揭示了葛根復方在重癥肌無力大鼠模型性中具有降低Drp1蛋白表達、減少線粒體的分裂、促進線粒體恢復和改善骨骼肌組織的功效。由于線粒體融合蛋白、分裂蛋白是維持線粒體功能的重要蛋白，本實驗只對線粒體分裂蛋白進行檢測，未對融合蛋白檢測，故存在一定的不足，因此在以后的實驗將對融合蛋白進行研究。