保元湯活性成分4’,7,8-三羥基二氫黃酮抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用機(jī)制研究

孟英心 張子歆 王凌瀟 馬家樂(lè) 靳鳳玉 王鑫玉 趙一慕 鄭姣 屠鵬飛

氧化應(yīng)激損傷是多種心血管疾病的重要誘因，包括動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、心力衰竭等[1]。心血管疾病發(fā)病過(guò)程中，血液中的氧自由基和氧化低密度脂蛋白通過(guò)激活血管內(nèi)皮表面的細(xì)胞信號(hào)通路刺激活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)氧化損傷，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，因此尋找安全有效的抗氧化先導(dǎo)化合物是目前藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。保元湯最早記載于《博愛明鑒》，是根據(jù)李東垣的黃芪湯所更改得來(lái)，包含人參、黃芪、肉桂、甘草四味藥材，在中醫(yī)理論上具有大補(bǔ)元?dú)狻⒅我磺性獨(dú)馓撊踔Y的功效[2]。

近幾年來(lái)保元湯在心血管疾病的臨床應(yīng)用上有著確切療效[3]。本課題組前期對(duì)保元湯的化學(xué)成分做了系統(tǒng)的分離鑒定，共鑒定出皂苷類、黃酮類等236個(gè)化合物[4]，其中甘草與黃芪中的大量黃酮類成分可能是保元湯抗氧化的藥效物質(zhì)。通過(guò)前期篩選發(fā)現(xiàn)4＇,7,8-三羥基二氫黃酮(4＇,7,8-trihydroxydihydroflavonoid，TF)具有較強(qiáng)的抗氧化作用，因此本研究對(duì)TF改善人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的過(guò)氧化損傷進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，以期闡明保元湯抗氧化的藥效物質(zhì)和作用機(jī)制，為其治療心血管疾病的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 保元湯處方與飲片

保元湯由黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)，人參(PanaxginsengC. A. Mey.)，甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)和肉桂(CinnamomumcassiaPresl)以6∶2∶2∶1的比例混合而成。原料藥材于河北省安國(guó)藥材市場(chǎng)購(gòu)買，由屠鵬飛教授鑒定。TF從保元湯總提物中分離得到(圖1)，純度大于98%。

圖1 4’,7,8-三羥基二氫黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.2 TF的提取與分離

取黃芪飲片30 kg，人參藥材10 kg，炙甘草飲片10 kg，肉桂藥材5 kg，混合，以10倍量去離子水煎煮三次，每次2小時(shí)，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮保元湯至密度約為1.10 kg/L，離心得保元湯提取液。保元湯提取液經(jīng)AB-8型大孔吸附樹脂純化，依次用3倍柱體積的水和不同濃度的乙醇(15%、30%、50%和95%乙醇)洗脫，收集50%乙醇洗脫液，減壓濃縮，干燥，即得50%乙醇洗脫部位(623.4 g)。50%乙醇洗脫部位經(jīng)硅膠(100～200目)柱色譜分離，氯仿-甲醇-水(95∶5∶0.5，90∶10∶1，85∶15∶1.5，80∶20∶2，70∶30∶3)梯度洗脫，TLC檢測(cè)，合并得10個(gè)流分(A-J)。G(2.5 g)再經(jīng)硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇-水(85∶15∶1.5)洗脫，TLC檢測(cè)，合并得3個(gè)流分(G1-G3)。G3(729 mg)經(jīng)反相柱色譜分離，甲醇-水(5∶95→70∶30)梯度洗脫，得到化合物TF(10 mg)。保元湯活性化合物的分離，以及4’,7,8 -三羥基二氫黃酮的結(jié)構(gòu)鑒定由北京大學(xué)藥學(xué)院研究生馬曉麗完成。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)：11965092)、青霉素-鏈霉素(批號(hào)：15140163)、胎牛血清(批號(hào)：12483020)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(批號(hào)：20012050)、胰酶(批號(hào)：25200072)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；維生素C(批號(hào)：B21293)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；CCK-8試劑盒(批號(hào)：BN15201)購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；活性氧檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：S0033S)、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(ABTS法)(批號(hào)：S0119)、RIPA裂解液(批號(hào)：P0013B)均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PARP(批號(hào)：60004-1-Ig)、β-actin(批號(hào)：60004-1-Ig)、GAPDH(批號(hào)：60004-1-Ig)、P-Akt(批號(hào)：66444-1-Ig)、Bcl-2(批號(hào)：60178-1-Ig)均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)PerkinElmer公司)；冷凍離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf公司)；CriterionTM型電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司)；DYY-6D型電泳儀(北京六一儀器廠)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)由北京大學(xué)曾克武教授贈(zèng)予。HUVEC采用含10%滅活胎牛血清，1%的青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換1次培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞后，取1 mL胰酶于培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞1分鐘左右；終止消化后收集細(xì)胞，800 r/min離心5分鐘，棄上清，加入完全培養(yǎng)液，適當(dāng)比例傳于培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 H2O2誘導(dǎo)的HUVEC氧化損傷模型建立

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和H2O2處理組(給予不同濃度的H2O2)，每組每濃度設(shè)置六個(gè)復(fù)孔。HUVEC細(xì)胞以5×103個(gè)/孔均勻接種于96孔板，生長(zhǎng)24小時(shí)后，對(duì)照組用完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞；H2O2處理組每孔加入DMEM培養(yǎng)基和終濃度分別為10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L、60 μmol/L的H2O2，孵育1小時(shí)。取出以CCK-8試劑稀釋10倍，每孔加入100 μL，置于37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)后，利用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值。

1.6 TF對(duì)H2O2損傷HUVEC存活率的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC細(xì)胞以5×103個(gè)/孔均勻接種于96孔板，生長(zhǎng)24小時(shí)后，設(shè)置對(duì)照組、模型組、TF低、中、高劑量組(終濃度分別為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L)，每組設(shè)置六個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，不做任何處理。TF低、中、高劑量組處理細(xì)胞6小時(shí)后，再分別用終濃度為15 μmol/L、30 μmol/L的H2O2刺激細(xì)胞1小時(shí)。細(xì)胞加入CCK-8試劑并置于37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)后，利用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值。

按照以上分組方法，TF預(yù)處理細(xì)胞6小時(shí)后，對(duì)模型組與TF低、中、高劑量組以終濃度為20 μmol/L的H2O2處理細(xì)胞1小時(shí)，置于顯微鏡下觀察HUVEC細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)學(xué)變化。

1.7 檢測(cè)指標(biāo)

1.7.1 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 按照1.6項(xiàng)下方法接種細(xì)胞、分組、造模及給藥。根據(jù)DCF-DA試劑盒操作方法測(cè)定ROS。

1.7.2 TF對(duì)DPPH自由基體外清除的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[5]測(cè)定TF對(duì)DPPH自由基的清除活性。取2 mL 0.16 mmol/L DPPH自由基溶液分別加入到2 mL不同濃度的TF溶液中(10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L)，每組設(shè)置六個(gè)復(fù)孔。在室溫下避光30分鐘后。在517 nm下測(cè)量反應(yīng)混合物的OD值，溶液褪色程度與藥物清除自由基活性呈正相關(guān)，并以天然抗氧化劑維生素C用作陽(yáng)性對(duì)照。

1.7.3 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 HUVEC細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以5×103個(gè)/孔均勻接種于12孔板，設(shè)置對(duì)照組、模型組、TF低、中、高劑量組(終濃度分別為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L)。對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，不做任何處理。TF低、中、高劑量組處理細(xì)胞6小時(shí)后，再以終濃度為20 μmol/L的H2O2處理1小時(shí)。收集細(xì)胞，加入4℃預(yù)冷的SDS細(xì)胞裂解液100 μL充分裂解后離心制備蛋白樣品。在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離蛋白質(zhì)樣品并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用TBST配制的5%脫脂乳封閉2小時(shí)后，將膜與一抗在4℃下孵育過(guò)夜，洗滌印跡并與二抗在室溫下孵育2小時(shí)，將膜再次用TBST洗滌3次，使用ECL試劑對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行可視化，并用Image J軟件進(jìn)行定量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 H2O2對(duì)HUVEC細(xì)胞存活率的影響

通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)H2O2濃度對(duì)HUVEC細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，H2O2處理組細(xì)胞的存活率明顯降低(P<0.05)，IC50=(19.86±0.98)μmol/L，因此本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇15 μmol/L和30 μmol/L濃度的H2O2損傷HUVEC細(xì)胞。見表1。

表1 CCK-8法檢測(cè)不同濃度的H2O2對(duì)HUVEC細(xì)胞存活率的影響

2.2 TF對(duì)H2O2損傷HUVEC細(xì)胞存活率的影響

使用15 μmol/L的H2O2損傷HUVEC細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，模型組HUVEC細(xì)胞存活率降低至(76.30±5.31)%(P<0.05)，中、高劑量TF給藥后均顯著提高細(xì)胞存活率(P<0.01)，分別提高(27.42±2.81)%和(42.30±1.41)%。見表2。

表2 TF對(duì)15 μmol/L H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞存活率的影響

使用30 μmol/L H2O2損傷HUVEC細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，模型組HUVEC細(xì)胞存活率降低至(23.90±0.59)%(P<0.05)，中、高劑量TF給藥后均顯著提高細(xì)胞存活率(P<0.05)，分別提高(63.72±12.01)%和(146.43±8.80)%。見表3。

表3 TF對(duì)30 μmol/L H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞存活率的影響

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，終濃度為20 μmol/L的H2O2處理細(xì)胞后，細(xì)胞數(shù)量大量減少，胞體邊緣模糊，折光性減弱，貼壁能力降低。20 μmol/L濃度TF給藥后，HUVEC細(xì)胞數(shù)量較模型組顯著上升，細(xì)胞折光性及貼壁功能恢復(fù)良好。綜上得出，TF預(yù)處理能夠抑制H2O2所致的HUVEC的氧化應(yīng)激損傷。見圖2。

注： A 對(duì)照組; B 模型組; C TF低劑量組; D TF中劑量組; E TF高劑量組

2.3 TF對(duì)H2O2損傷HUVEC細(xì)胞ROS水平的影響

DCFH-DA熒光探針可以在細(xì)胞內(nèi)水解生成DCFH，進(jìn)而被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化，生成可以產(chǎn)生綠色熒光的DCF。當(dāng)細(xì)胞受到氧化損傷，細(xì)胞內(nèi)的ROS含量增加，熒光強(qiáng)度會(huì)增加。模型組用20 μmol/L的H2O2造模，與模型組相比較，TF低、中、高劑量組綠色熒光逐漸減弱，顯示細(xì)胞內(nèi)ROS水平減少，且呈劑量依賴性。綜上，TF預(yù)處理能夠降低HUVEC細(xì)胞ROS水平。見圖3。

注： A 模型組; B TF低劑量組; C TF中劑量組; D TF高劑量組

2.4 TF對(duì)DPPH自由基的清除作用

通過(guò)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證TF對(duì)自由基的體外清除作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，終濃度10 μmol/L的TF就可顯著增加自由基的清除(P<0.05)，終濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)自由基清除率可達(dá)到(93.69±1.06)%，與相同劑量陽(yáng)性藥維生素C的自由基清除效果相似，表明TF具有良好的自由基清除活性。見表4。

2.5 TF對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

20 μmol/L劑量H2O2損傷細(xì)胞后，HUVEC細(xì)胞中磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，P-Akt)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)以及腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly adenosinedip-hosphate-ribose polymerase，PARP)的含量顯著降低(P<0.05) ，而Cleaved PARP的含量顯著增加(P<0.05)， 表明細(xì)胞凋亡程度增強(qiáng)。 TF給藥后，能劑量依賴地增加P-Akt和Bcl-2的含量，抑制PARP蛋白的裂解，較模型組具有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)果證實(shí)TF通過(guò)P-Akt調(diào)控PARP的裂解，從而改善HUVEC細(xì)胞凋亡。結(jié)果見圖4，表5。

表4 TF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞DPPH自由基清除的影響

圖4 TF對(duì)H2O2誘導(dǎo)后的HUVEC細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表5 TF對(duì)H2O2誘導(dǎo)后的HUVEC細(xì)胞中P-Akt、Bcl-2、Cleaved PARP、PARP表達(dá)的影響

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是心血管疾病最重要的病理改變之一，可導(dǎo)致包括動(dòng)脈粥樣硬化在內(nèi)的心血管疾病的形成和發(fā)展[6]。因此，從中草藥中篩選出具有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的活性先導(dǎo)化合物具有重要的臨床意義[7]。根據(jù)記載保元湯可保守真元之氣，提高免疫，延緩衰老，且已被證明有抗氧化作用[8-9]，本課題組前期篩選了保元湯中的藥物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TF的抗氧化性最佳，因此選擇該藥物進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

氧化應(yīng)激是指活性氮自由基或ROS等高活性酶的過(guò)量產(chǎn)生，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA損傷、細(xì)胞凋亡或壞死。H2O2已被廣泛用于刺激不同細(xì)胞類型的氧化應(yīng)激[10]。這種非自由基氧化劑和可擴(kuò)散分子已被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞中促凋亡和促壞死的氧化介質(zhì)，不同濃度和孵育時(shí)間已經(jīng)用于評(píng)估不同研究中的H2O2細(xì)胞毒性[11-12]，CCK-8法檢測(cè)顯示，用15 μmol/L和30 μmol/L的H2O2處理HUVEC細(xì)胞1小時(shí)，HUVEC細(xì)胞存活率明顯降低至45%～55%，并具有一定的劑量依賴性，造模條件穩(wěn)定，因此確定此條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。本研究通過(guò)CCK-8法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)TF給藥后，細(xì)胞存活率呈濃度依賴性提高，提示TF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷有良好的保護(hù)作用。在本研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)H2O2顯著誘導(dǎo)HUVEC中ROS的形成，而TF實(shí)驗(yàn)組逆轉(zhuǎn)了H2O2對(duì)ROS形成的促進(jìn)作用，說(shuō)明TF可能通過(guò)抑制ROS的形成來(lái)發(fā)揮其抗氧化作用。

本文進(jìn)一步研究了TF對(duì)DPPH自由基的清除作用，發(fā)現(xiàn)TF可以通過(guò)清除自由基DPPH發(fā)揮抗氧化作用。為了繼續(xù)探究TF抑制H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞損傷的作用機(jī)制，本課題組評(píng)估了TF對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起到著重要的作用，當(dāng)磷脂酰肌醇-3激酶被激活時(shí)，Akt會(huì)被細(xì)胞外因子激活，發(fā)生構(gòu)象改變，暴露其磷酸化位點(diǎn)，形成P-Akt[13]。P-Akt被激活后，線粒體途徑的Bcl-2也會(huì)被激活。Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，過(guò)量表達(dá)可以改變線粒體膜的通透性，抑制巨孔形成，防止細(xì)胞色素c從線粒體中釋放，抑制細(xì)胞凋亡[14]。PARP是一種DNA修復(fù)酶，對(duì)DNA的損傷修復(fù)以及細(xì)胞凋亡起著重要的作用，受到上游P-Akt與Bcl-2的調(diào)控[15]。為了進(jìn)一步探討TF對(duì)H2O2所致的HUVEC損傷細(xì)胞的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western Blot法觀察了不同處理后P-Akt、Bcl-2以及PARP表達(dá)量，結(jié)果表明TF預(yù)處理可以顯著改善H2O2所致的HUVEC細(xì)胞內(nèi)P-Akt、Bcl-2以及PARP的表達(dá)異常。綜上所述保元湯中的單體化合物TF可以通過(guò)調(diào)控P-Akt/PARP/Bcl-2通路抑制HUVEC細(xì)胞的凋亡，從而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)氧化損傷，因此，TF可能是一種很有前景的抗氧化損傷和氧化應(yīng)激相關(guān)心血管疾病的藥物。

保元湯是治療元?dú)馓撊醯慕?jīng)典名方，臨床上應(yīng)用于心血管疾病的治療，療效確切，安全性好。在前期的研究中，研究人員更加集中于其臨床療效的探索，而缺乏物質(zhì)基礎(chǔ)跟藥理學(xué)方面的研究。本研究在前期對(duì)分離鑒定出的保元湯的化學(xué)成分活性篩選的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)保元湯中的化學(xué)成分TF具有較強(qiáng)的抗氧化作用，通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的過(guò)氧化損傷模型，明確了TF改善血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)氧化損傷的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了保元湯保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥效物質(zhì)，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。