益氣化瘀解毒方對脂多糖誘導的急性呼吸窘迫綜合征模型大鼠Cav-1/IL-12/IL-13表達的影響

鄒喬 李雁 陳一凡 孔煜榮 陳瑜

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是由多種肺內(如肺炎、誤吸等)或肺外因素引起的，以難治性低氧血癥和進行性呼吸窘迫為主要表現的臨床急危重癥。流行病學調查數據顯示，中國每年約有67萬ARDS患者，全球范圍內ARDS的病死率為30%～40%[1]。目前，臨床僅以保護性俯臥位機械通氣作為較高等級證據支持的治療措施，仍亟需安全有效的防治手段進行干預[2]。Meta分析研究表明，中西醫結合治療ARDS在降低病死率、減少平均機械通氣時間、改善氧合指數、下調促炎因子等方面優勢明顯[3]。

本實驗所采用的益氣化瘀解毒方為全國名老中醫藥專家、首都國醫名師杜懷棠教授根據多年臨床診療經驗，針對ARDS肺氣虛衰，毒瘀閉肺[4]的關鍵病機而創設的經驗方。前期實驗研究發現，益氣化瘀解毒方中劑量組(即本實驗中藥復方組采用的劑量)可顯著調節脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的ARDS模型大鼠炎癥通路蛋白核因子NF-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)p65/p50、NF-κB抑制因子α(inhibitor of NF-κB，IκBα)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)及炎癥因子白細胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達水平[5-8]；又運用生物信息學方法分析[9]，推測本方可能通過上調小窩蛋白-1(caveolin-1, Cav-1)而干預ARDS炎癥級聯反應。因此，本研究通過觀察益氣化瘀解毒方對ARDS模型大鼠Cav-1蛋白及炎癥因子IL-12、IL-13表達水平的影響，探討益氣化瘀解毒方調控ARDS炎癥反應的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級雄性SD大鼠18只，6～7周齡，體質量(180±10)g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2019-0008，于北京中醫藥大學東直門醫院實驗動物中心屏障實驗室分籠飼養，每籠6只，普通飲食。適應性喂養3天后開始實驗。本次動物實驗研究通過北京中醫藥大學東直門醫院實驗動物福利與倫理委員會審批，編號：19-54。

1.2 實驗藥物

中藥復方(包括黃芪30 g、黃芩10 g、金銀花15 g、三七10 g、赤芍15 g、炒枳實12 g、葶藶子15 g、桑白皮15 g，由中國中醫科學院中藥研究所提供并制成中藥浸膏，批號：20191030)。

1.3 主要試劑與儀器

大腸桿菌LPS(Sigma，L6511)；Caveolin-1 rabbit polyclonal antibody(Proteintech，16447-1-AP)；大鼠Cav-1 ELISA試劑盒(江蘇酶標生物科技有限公司，MB-7123A)大鼠IL-12 ELISA試劑盒(江蘇酶標生物科技有限公司，MB-7125B)；大鼠IL-13 ELISA試劑盒(江蘇酶標生物科技有限公司，MB-1626B)；BH2光學顯微鏡(OLYMPUS)；高速離心機(Thermo)；Varioskan Flash光譜掃描多功能讀數儀(Thermo Scientific)。

1.4 動物分組、給藥與造模

將SD大鼠隨機分為對照組、模型組、中藥復方組3組，每組6只。結合既往實驗研究確定的最佳造模時間、劑量與給藥劑量，按12.2 g/(kg·d)(給藥劑量為生藥劑量)用蒸餾水將中藥浸膏配制為中藥溶液，予中藥復方組大鼠每日灌胃給藥，對照組、模型組大鼠灌服等量蒸餾水，均用60℃溫水浴加熱后灌胃，灌胃量1 mL/(100 g·d)，每日1次，連續7日。第7日灌胃后6小時，模型組、中藥復方組一次性尾靜脈注射LPS溶液(2 mg/kg)，對照組尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液(2 mg/kg)，16小時后3%戊巴比妥鈉(0.1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。

1.5 標本采集與觀測指標

1.5.1 肺組織病理 充分暴露大鼠胸腔，摘取全肺，分離右下肺制作病理切片，經組織切片、常規脫蠟、蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色、分色、脫水、封片等步驟，在光學顯微鏡下觀察各組肺泡與肺間質形態、充血水腫及炎癥細胞浸潤程度等肺組織病理情況。肺組織病理切片及HE染色均在北京中醫藥大學科研實驗中心形態學檢測平臺制作完成。

1.5.2 酶聯免疫法(enzyme lirked immunosorbent assay,ELISA)檢測肺泡灌洗液、肺勻漿Cav-1及血清IL-12、IL-13表達水平 大鼠開胸結扎右肺門后，用PBS反復3次進行左支氣管肺泡灌洗，回收肺泡灌洗液，經3 000 r/分鐘、4℃離心10分鐘后，取上清液置于-80℃冰箱中保存備用；分離右上肺，剪碎肺組織樣本，加入組織裂解液，冰水混合物中行組織勻漿，經12 000 r/分鐘、4℃離心5分鐘后，取上清液置于-80℃冰箱中保存備用；打開腹腔，暴露腹主動脈，取腹主動脈血3～5 mL于肝素化試管中，經3 000 r/分鐘、4℃離心20分鐘后，取血清置于-80℃冰箱中保存備用。按照ELISA試劑盒操作說明進行測定。檢測肺泡灌洗液Cav-1及血清IL-12、IL-13表達水平時，將肺泡灌洗液、血清樣本PBS稀釋5倍后測定；檢測肺勻漿Cav-1表達水平時，將肺勻漿樣本用PBS稀釋200倍后測定。

1.5.3 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測肺勻漿Cav-1表達水平 提取肺組織總蛋白，10 000 r/分鐘、4℃離心15分鐘，BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠部分80 V、30分鐘，觀察跑到分離膠部分以后，120 V、90分鐘；轉膜用80 V、70分鐘；5%的脫脂奶粉室溫封閉1小時。加入一抗稀釋液，稀釋的一抗抗體(1∶2 000)，孵育、洗滌，再加入相應二抗(1∶10 000)，ECL化學發光檢測，暗室中顯影。采用成像分析系統Quantity One測量并記錄圖像灰度值。

1.6 數據處理

2 結果

2.1 大鼠肺組織病理觀察結果

對照組大鼠肺組織病理可見肺泡結構清晰完整，肺泡腔及間質無充血水腫，未見炎性細胞浸潤；模型組大鼠肺泡腔及間質結構變形，肺泡壁增厚，部分肺泡塌陷，可見炎性滲出；中藥復方組較模型組大鼠肺組織損傷程度減輕，炎性滲出及出血較少，肺泡結構較完整，塌陷較少。見圖1。

注：×200：A 對照組；B 模型組；C 中藥復方組；×400：D 對照組；E 模型組；F 中藥復方組。

2.2 ELISA法檢測大鼠肺泡灌洗液、肺勻漿Cav-1蛋白表達情況

肺泡灌洗液中，與對照組相比，模型組Cav-1水平顯著減少(P<0.01)；與模型組相比，中藥復方組Cav-1水平顯著增多(P<0.05)。肺勻漿中，與對照組相比，模型組Cav-1水平顯著減少(P<0.01)；與模型組相比，中藥復方組Cav-1水平顯著增多(P<0.01)。見表1。

表1 各組ARDS模型大鼠肺泡灌洗液、肺勻漿中Cav-1蛋白表達水平比較(ELISA法)

2.3 Western Blot法檢測大鼠肺勻漿Cav-1蛋白表達情況

肺勻漿中，與對照組相比，模型組Cav-1表達顯著下調(P<0.01)；與模型組相比，中藥復方組Cav-1表達顯著上調(P<0.01)。見表2及圖2。

表2 各組ARDS模型大鼠肺勻漿Cav-1蛋白表達水平比較

圖2 各組ARDS模型大鼠肺勻漿Cav-1蛋白表達情況

2.4 大鼠血清IL-12、IL-13表達情況

與對照組相比，模型組IL-12水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，中藥復方組IL-12水平顯著降低(P<0.01)；與對照組相比，模型組、中藥復方組IL-13水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠ELISA檢測血清IL-12、IL-13表達水平比較

3 討論

3.1 Cav-1/IL-12/IL-13在LPS誘導的ARDS發病中的作用

膿毒癥是ARDS最常見、最嚴重的病因之一，嚴重感染者有25%～50%發生ARDS，病死率高達70%～90%[10]。其發病主要由革蘭氏陰性桿菌侵襲所致，LPS為革蘭氏陰性桿菌細胞壁的主要成分之一，故本實驗采用基礎研究中廣泛應用的LPS尾靜脈注射進行造模，模型組大鼠肺組織病理可見ARDS典型特點，表明復制ARDS模型成功。

Cav-1是一種22 kDa的跨膜支架蛋白，在肺損傷的發病機制中起著至關重要的作用[11]。研究發現，Cav-1蛋白表達水平的下調常伴隨ARDS相關炎癥因子及NF-κB等炎癥通路相關蛋白表達水平的上調[12-15]。LPS可激活Cav-1[16]，使其與LPS受體Toll樣受體4相互作用，降解IκBα，活化NF-κB，并從細胞質轉移到細胞核內，啟動一系列炎癥因子轉錄及爆發性表達，引起肺內以巨噬細胞和中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，破壞肺組織正常結構及功能。本實驗中模型組大鼠肺泡灌洗液、肺勻漿中Cav-1蛋白表達水平均較對照組明顯下調，說明Cav-1減少在ARDS發病中具有重要意義。

炎癥因子IL-12、IL-13主要由活化的單核/巨噬細胞產生。研究發現，LPS刺激可分別引起肺組織、血漿中促炎因子IL-12及抑炎因子IL-13表達增加[17-18]。同時，抑炎因子IL-4、IL-10、IL-13可抑制IL-12、γ干擾素、TNF-α的產生[19]，而IL-12除促進炎癥因子γ干擾素表達形成正反饋外，也可抑制IL-4、IL-13的表達[20]，因此IL-12/IL-13的表達常處于一定的平衡。LPS誘導全身炎癥反應所致的ARDS可能與促炎因子IL-12與抑炎因子IL-13的表達失衡有關。本實驗中模型組IL-12、IL-13較對照組均升高，與既往研究結果一致，說明ARDS發病過程中炎癥級聯反應的出現可能與促炎與抑炎因子表達水平的變化密切相關。

3.2 益氣化瘀解毒方防治ARDS作用機理分析

中醫學在歷代發展中積累了豐富的急救醫療經驗，根據ARDS的臨床表現，可將其歸屬于“喘脫”“暴喘”等范疇[21]。本病多因患者感受邪毒，壅滯于肺，肺失宣肅，水道不通，飲熱互結，百脈不暢，瘀血內阻，痹肺傷肺而發病。益氣化瘀解毒方用生黃芪益氣扶正，祛邪防變；金銀花、黃芩清熱解毒，透邪外出；桑白皮、葶藶子、枳實瀉肺逐飲，降氣平喘；三七、赤芍化瘀通絡，涼血解毒。全方扶正祛邪兼顧，化瘀解毒而不傷正，益氣扶正而不礙邪。

本實驗中藥復方組大鼠肺組織病理可見肺損傷程度明顯減輕，表明中藥復方對ARDS可起到良好的防治效果。中藥復方組Cav-1蛋白表達水平較模型組顯著上調，促炎因子IL-12表達水平較模型組明顯減少；中藥復方組與模型組抑炎因子IL-13表達水平均較對照組升高，說明益氣化瘀解毒方能上調Cav-1水平，增加抑炎因子表達，減少促炎因子表達，起到減輕炎癥反應、降低肺損傷的作用。關于中藥復方是否通過Cav-1蛋白對ARDS炎癥級聯反應起到關鍵調控作用的直接證據仍有待在今后的實驗中進一步闡明。