多巴胺表面修飾角蛋白/聚乳酸納米纖維膜的制備及性能

王喜倩，尹國強，2，郭清兵，何明

（1 仲愷農業工程學院化學化工學院，廣東 廣州 510225；2 廣州市農用化學品高效利用重點實驗室，廣東 廣州 510225）

角蛋白作為一種天然可再生的生物材料，具有良好的生物相容性和生物降解性，其分子結構中含有促進動物細胞黏附、增殖的氨基酸序列并能促進傷口愈合，故在醫用傷口敷料領域擁有巨大的開發潛力。傳統的傷口敷料旨在覆蓋傷口表面，而良好的傷口敷料需具備優良的透氣性、吸收性、無創性和安全性。通過靜電紡絲技術可制備比表面積大、孔隙率高、孔尺寸均勻，具有良好的透氣性的納米纖維膜。但由于角蛋白可紡性差，需加入高分子聚合物與其混合才能制備納米纖維膜。常用的高分子聚合物有明膠、聚乙烯醇、聚氨酯和聚己內酯等。聚乳酸（PLA）是一種新型的生物降解材料，具有良好的可紡性和力學性能，將聚乳酸與角蛋白共混不僅能解決角蛋白可紡性差的問題，還能提高其力學性能。盡管如此，角蛋白與聚乳酸共混制備的納米纖維膜在力學性能和細胞活性方面還是存在不足。

多巴胺（DA）是內源性含氮有機化合物，對人體無害，且含有較多活性基團，能與角蛋白的側鏈基團發生化學反應，同時多巴胺的自聚、表面修飾與黏附作用不僅能彌補了PLA 等高分子聚合物無生物活性的缺點，提高材料細胞的親和力及組織黏附力，還能提高復合材料的機械性能。

1 實驗

1.1 實驗材料與儀器

羽毛角蛋白（FK），實驗室自提取，具體實驗細節參照參考文獻[16]。雞羽毛，廣州市場收集的新鮮雞羽毛；過氧乙酸，分析純，天津福晨化學試劑廠；氫氧化鈉，分析純，天津大茂化學試劑有限公司；PLA，=300000，美國Nature work 公司；DA，98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；六氟異丙醇，分析純，上海麥克林生物科技有限公司。人皮膚成纖維細胞（HSF）專用培養基，生物學級，上海賽百慷生物；磷酸緩沖液（PBS），生物學級，Procell；胰蛋白酶，生物學級，Biosharp；二甲基亞砜（DMSO），生物學級，天津富宇精細化工有限公司；噻唑藍（MTT），生物學級，北京索萊寶科技有限公司；4,6?二脒基?2?苯基吲哚（DAPI），生物學級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。ET?2535DC 型靜電紡絲機，北京永康樂業科技發展有限公司；UV 燈，龍光固24W，廣州市豪斯發五金有限公司；掃描電子顯微鏡，EVO18，德國蔡司公司；傅里葉變換紅外光譜儀，Spectrum100， 美 國PE 公 司； 熱 重 分 析 儀，TG209F1，德國NETZSCH 公司；接觸角測量儀，DSA100，德國KRUSS 公司；電子萬能試驗機，CMT6503，美特斯深圳工業有限公司；CO恒溫培養箱，WIGGENS WCI ?180，北京桑翌實驗儀器研究所；超凈工作臺，SW?CJ?2FD，上海篤特科學儀器有限公司；酶標儀，SPARK 10M，TECAN；激光共聚焦顯微鏡，LSM880，ZENISS。

1.2 FK/PLA納米纖維膜的制備

按照質量比為3∶7 分別稱取0.48g FK 和1.12g PLA 于溶樣瓶中，向溶樣瓶中加入六氟異丙醇溶液，并定容至20g。配液完成后，將溶樣瓶置于37℃恒溫水浴鍋中連續攪拌12h，制備得到FK含量為8%的FK/PLA 混合紡絲液。本實驗采用ET?2535DC型靜電紡絲機，將紡絲液裝入帶有22號針頭的注射管，設置電壓為20kV、流速為0.6mL/h、接收距離為12cm 的紡絲參數下以錫紙接收持續紡絲，制備具有一定厚度的FK/PLA納米纖維。

1.3 多巴胺表面修飾FK/PLA納米纖維膜

取一定量的DA 溶于去離子水中，并用1mol/L氫氧化鈉調節pH 為7.0，制得濃度分別為0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L的DA溶液。

將上述靜電紡絲制得的FK/PLA 納米纖維膜浸漬于不同濃度的新配的DA溶液中，在35℃恒溫水浴鍋下用波長為365nm的UV燈照射3h。3h后撤去UV 燈，繼續在35℃恒溫水浴鍋里靜置反應3h。3h后取出納米纖維膜，用去離子水反復沖洗3次，洗凈后將納米纖維膜置于溫度為25℃、相對濕度為57%的恒溫恒濕箱中烘干，烘干后得到聚多巴胺（PDA）改性的FK/PLA納米纖維膜。

1.4 結構表征與性能測試

掃描電鏡（SEM）：采用掃描電子顯微鏡觀察改性前后納米纖維膜的微觀形貌，加速電壓為15kV。

傅里葉變換紅外光譜（FTIR）：采用衰減全反射模式（attenuated total reflection，ATR）對膜樣品、粉末樣品進行測定，掃描范圍為4000～600cm，分辨率為4cm，掃描次數為8次。

熱重分析（TGA）：稱取3～5mg 的膜樣品，在氮氣環境下，升溫速度為10℃/min，測量溫度范圍為室溫至700℃。

接觸角實驗：溶劑選用去離子水，選取滴落2s 時水滴與膜樣品間左右兩側接觸角的平均值作為評價標準。

力學性能測試：試樣尺寸為1cm×6cm，拉伸速度設定為10mm/min，夾距為40mm，按照GB/T1040.3—2006標準執行。

1.5 生物相容性

1.5.1 細胞活性毒性測試

采用MTT 比色法，以HSF 作為實驗細胞對表面修飾前后膜樣品的生物相容性進行評價。將膜樣品裁剪成直徑為0.6mm的小圓片，將200μL的細胞懸液和培養基接種在膜樣品上，進行細胞活性檢測；將膜樣品裁剪成10mm×10mm 的方塊，置于2mL 的離心管中，并加入一定量的DMEM 培養液，得到不同DA 濃度浸泡的FK/PLA 納米纖維膜的浸提液。取一定量的浸提液，并加入200μL/孔的HSF細胞懸液和培養基，進行細胞毒性檢測。通過式(1)計算細胞相對增殖率。

式中，OD為待測樣品在測試波長為570nm下的吸光度；OD為陰性對照組的吸光度。

1.5.2 細胞黏附性（DAPI染色）

DAPI 可以快速進入活細胞并與DNA 結合而發出熒光，在顯微鏡下采用波長為405nm的激發光激發可以使細胞核呈藍色。所以通過DAPI 染色可以觀察到材料表面活細胞的數目，并作為進一步評價材料的細胞黏附性與生物相容性方法。

以HSF 作為實驗細胞。將膜樣品裁剪成能夠平鋪在24 孔板底部的大小，裁剪后的膜樣品正反面均進行紫外照射30min的滅菌處理，向裝有膜樣品的24 孔板的每個孔中準確加入1mL 的HSF 細胞懸液和培養基，置于5% CO、37℃恒溫培養箱中培養24h 后，進行DAPI 染色，染色后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果與討論

2.1 FK/PLA納米纖維膜的SEM圖

圖1 為FK/PLA 與UV 照射不同濃度DA 溶液浸泡修飾的FK/PLA納米纖維膜在SEM下觀察到的纖維形貌圖，圖2為采用Image pro plus軟件對其納米纖維直徑進行統計得到的纖維平均直徑圖。從圖中可以看出，未經PDA溶液浸泡改性的FK/PLA納米纖維形貌相對均勻光滑，且纖維筆直，纖維間結構規整、較為松散，而經PDA 溶液浸泡修飾的FK/PLA納米纖維形貌發生了明顯的變化。具體表現在隨著DA濃度的增加，纖維表面逐漸粗糙且纖維出現了彎曲，纖維與纖維間亦出現了黏合、重疊和纏繞現象，整體形貌變得較為緊密。這是因為UV照射DA 溶液引發其聚合生成PDA，PDA 具有黏附性，黏附在納米纖維的表面使其表面粗糙，并且纖維與纖維間表面的PDA 相互黏結使得納米纖維間發生黏合、重疊、纏繞。特別地，當DA濃度大于1.5g/L時，纖維表面的顆粒聚集增加，大量的顆粒黏附在纖維表面致使納米纖維膜的孔隙減少。這是因為隨著多巴胺濃度的增加，UV 照射后生成的PDA 的含量亦升高，大量的PDA 沉積覆蓋在納米纖維膜上。由此可見，DA 溶液表面改性后的納米纖維膜其纖維平均直徑均大于FK/PLA 納米纖維膜，并且纖維平均直徑隨著DA 濃度的升高而增大。

圖1 不同濃度DA溶液浸泡的FK/PLA納米纖維膜的SEM圖

圖2 不同濃度DA溶液浸泡的FK/PLA納米纖維膜的平均直徑圖

2.2 K/PLA納米纖維膜的FTIR譜圖

如圖3(a)，對于PDA 修飾的FK/PLA 納米纖維膜，在FTIR譜圖可以觀察到其與未改性的FK/PLA納米纖維膜存在變化。2946cm原歸屬于PLA 的特征吸收峰變化成2921cm和2852cm特征吸收峰，它們對應于脂肪族—CH拉伸振動，該特征峰來自PDA 分子的烷基側鏈。如圖3(b)原FK/PLA在1245cm處羧酸的C—O 伸縮振動經PDA 改性后在1256cm出現新的吸收峰，該峰對應于芳香族C—N 伸縮振動。而此處出現的芳香族—NH來源于多巴胺聚合生成的PDA。故PDA 分子成功地沉積黏附在FK/PLA 納米纖維膜對其進行表面修飾。

圖3 純組分及不同濃度DA溶液浸泡的FK/PLA納米纖維膜的FTIR圖

2.3 FK/PLA納米纖維膜TG譜圖

不同濃度DA 溶液浸泡的FK/PLA 納米纖維膜的熱重分析圖如圖4 所示。從圖中可以看出，FK/PLA 與PDA 表面修飾的FK/PLA 納米纖維膜的熱降解過程均分為三個階段：第一階段的質量損失出現在40～150℃，該階段的質量損失來源于樣品中的水分蒸發，其質量損失為2%～3%；第二階段的質量損失出現在215～325℃，這階段質量損失主要是因為樣品中部分FK 和PDA 發生降解，該損失為6%～13%；第三階段的質量損失發生在325～500℃，這部分的質量損失是由于PLA 和PDA 表面涂層的FK/PLA的分解，為80%～90%。

從熱重圖中獲得的熱性能數據如表1所示，其中為樣品質量損失10%時溫度，為降解速度最快時的溫度（即DTA 峰值），當樣品質量損失10%時，改性后的納米纖維膜所需溫度均高于原FK/PLA 納米纖維，高27～39℃。結合圖4(b)，在熱降解的第二階段中，原FK/PLA 納米纖維的降解速率均大于PDA修飾的FK/PLA納米纖維膜，而在第三階段中，PDA 修飾的FK/PLA 納米纖維膜的最大降解速率普遍高于FK/PLA 納米纖維膜。這是由于PDA 修飾的FK/PLA 納米纖維膜表面有大量的氨基和羥基，這些基團之間相互作用形成氫鍵，使得PDA 修飾的FK/PLA 納米纖維膜熱穩定性得到提升。對于樣品的熱降解率，FK/PLA 的熱降解率為95.98%，而改性后的FK/PLA 熱降解率均大于原FK/PLA，這是由于改性后FK/PLA中的PDA的分解而導致樣品熱降解率的升高。

表1 不同濃度DA溶液浸泡的FK/PLA納米纖維膜的熱性能分析結果

圖4 不同濃度DA溶液浸泡的FK/PLA納米纖維膜的TG及DTG圖

2.4 FK/PLA納米纖維的力學性能

圖5為不同DA濃度溶液改性的FK/PLA納米纖維的彈性模量和斷裂伸長率，膜樣品的厚度范圍為0.11～0.13mm。結果表明PDA 修飾后FK/PLA 的彈性模量和斷裂伸長率均有提高，如彈性模量從原來的10.08MPa 提高到14.45～18.40MPa，斷裂伸長率從原來的61.00%提高到92.80%～112.50%。結合SEM，在宏觀上PDA 表面修飾后覆蓋在纖維表面，一方面增加了纖維的直徑，另一方面由于PDA 的黏附性，使得纖維黏合、重疊和纏繞在一起，促使納米纖維間的結構更為緊密，力學性能增加。而隨著PDA 濃度的增加，納米纖維表面覆蓋的PDA 層厚度和雜亂度增加，由PDA 本身具有脆性，故降低了其力學性能。從微觀上，PDA 分子有大量的酚羥基和氨基，這些基團與FK、PLA 相互作用，破壞了原FK 與PLA 之間的氫鍵使得FK 與PLA 的流動性得到改善，故增加了納米纖維的斷裂伸長率。隨著纖維表面與纖維間覆蓋沉積的PDA增加，限制了FK 與PLA 鏈段的流動性導致其斷裂伸長率下降。

圖5 不同濃度DA溶液浸泡的FK/PLA納米纖維膜的彈性模量和斷裂伸長率

2.5 FK/PLA納米纖維的親水性

圖6是不同DA溶液濃度改性后FK/PLA納米纖維膜的接觸角圖。結果表明，未經PDA修飾的FK/PLA納米纖維膜的接觸角為103.35°，親水性較差；而經PDA表面修飾的FK/PLA納米纖維膜的接觸角減少，并且隨著DA濃度的增加而逐漸減少。這是由于FK/PLA 經PDA 表面修飾后，纖維表面黏附、沉積的PDA 分子含有大量的羥基和氨基等親水性基團，從而增加了膜表面的親水性，良好的親水性有利于細胞的黏附、增殖，使得接觸角降低。

圖6 不同濃度DA溶液浸泡的FK/PLA納米纖維膜的接觸角圖

2.6 FK/PLA納米纖維的生物相容性

2.6.1 細胞活性毒性測試

如圖7(a)、(b)分別為不同DA 濃度改性的FK/PLA納米纖維膜樣品的細胞增殖活力，以此作為細胞活性的檢測和不同DA 濃度改性的FK/PLA 納米纖維膜樣品浸泡液的細胞增殖活力，以此作為細胞毒性的檢測。其中以HSF細胞接種在空白孔板上的增殖情況作為基準。

圖7 不同濃度DA溶液浸泡的FK/PLA納米纖維膜及其浸提液的細胞活力

對于膜樣品，在接種24h 時，FK/PLA 的細胞增殖活力較空白孔板差，而PDA修飾的FK/PLA細胞增殖活性均優于空白孔板上的細胞增值活力。這表明PDA修飾的FK/PLA納米纖維與HSF細胞生物相容性較好。隨著DA濃度的增加，細胞增殖活力亦升高，其中當DA 為3.0g/L 時細胞增值活力達到最高，為221%。這是由于PDA 分子具有豐富的羥基和氨基，不僅能增加膜的親水性和蛋白質吸附能力，還能有效改善并提高FK/PLA 納米纖維膜對HSF 細胞的黏附性，為細胞的生長和增殖提供支架。結合SEM分析，進一步升高DA濃度后，由于覆蓋的PDA 過多減少了納米纖維膜的空隙，導致細胞可黏附生長的區域減少，并且PDA 間相互黏附亦減少了細胞可黏附的PDA 數量，所以出現了細胞增殖活性降低的現象。在接種120h 時，細胞增殖活性較24h下降，這可能是由于膜樣品在培養基中浸泡時間過長，PDA分子分解成DA，DA被氧化成多巴胺醌（DAQ）。DAQ 能與細胞的蛋白相互作用導致細胞醌中毒使細胞活性降低，進而導致細胞的增殖活力下降。

對于膜樣品浸提液，接種24h時，由實驗結果可見，浸提液的細胞增殖率與空白孔板對照組相接近，而接種120h時，原FK/PLA浸提液的細胞增殖率下降，而PDA修飾的FK/PLA浸提液的細胞增殖率亦發生了變化，大體表現趨勢為隨著DA濃度的增加，較原FK/PLA，膜浸提液的細胞增殖率升高。其中，當DA 濃度為1.5g/L、2.0g/L、和3.0g/L 時，浸提液的細胞增殖率大于對照組，此時，浸提液對細胞增殖有一定的促進作用。這可能是因為膜樣品中的FK、PDA溶出，隨著時間的推移，FK分解產生氨等有毒物質影響了細胞的活性，從而導致細胞的增殖率下降。而PDA 表面修飾的FK/PLA，由于PDA 覆蓋在纖維的表面使得纖維中的FK 溶出量減少，并且伴隨著少量PDA 的溶出，使得浸提液的細胞增殖率有小幅度的提高。

2.6.2 細胞黏附性

將HSF 細胞接種在膜樣品上，利用DAPI 染色法觀察黏附在膜樣品表面的細胞密度。如圖8 所示，PDA 修飾的FK/PLA 納米纖維膜上的細胞密度均大于對照組和原FK/PLA，并且隨著DA濃度的升高，膜表面細胞密度增大。這表明改性后的納米纖維膜有良好的生物相容性，PDA 分子能提高細胞在膜表面的黏附性。

圖8 不同濃度DA溶液浸泡的FK/PLA納米纖維膜的熒光圖

3 結論

用PDA 表面修飾FK/PLA 納米纖維膜，分別對其微觀形貌、結構及性能進行表征，以評價其作為皮膚傷口敷料的可能性，結果表明，經PDA 表面修飾后，由于PDA 具有黏附性，PDA 黏附在納米纖維表面使得纖維間相互黏合、纏繞，提高了納米纖維平均直徑，并隨著其濃度升高而逐漸增大。UV 引發了DA 氧化自聚，生成的PDA 分子成功黏附在了FK/PLA 納米纖維膜表面。PDA 表面修飾后的FK/PLA 納米纖維膜的熱穩定性有所提高，并且亦提高了其熱降解效率。經PDA 表面修飾后，納米纖維膜的彈性模量和斷裂伸長率均得到改善。膜表面的親水性能提高。FK/PLA 納米纖維膜經PDA表面修飾后更有利于HSF 細胞的黏附、增殖，其具有較好的細胞活性。但是隨著時間的延長，由于PDA分解、氧化，使得細胞活性下降。

PDA 表面修飾的FK/PLA 納米纖維膜不僅具有較好的力學性能，還有較好的細胞活性與細胞黏附性，故其作為皮膚傷口敷面材料具有潛在的可能性。