肌少-骨質(zhì)疏松癥大鼠模型的建立

馬江濤 黃佳純 黃潤龍 萬雷 黃紅 黃宏興*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心中醫(yī)骨傷科學(xué)實驗室，廣東 廣州 510006 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510375 4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)護理學(xué)院，廣東 廣州 510006

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量降低、骨微結(jié)構(gòu)損害及骨脆性增加為特征的骨骼系統(tǒng)疾病[1]，肌少癥(sarcopenia，SP)或肌肉衰減綜合征是以肌力、肌量或肌肉功能下降為特征的肌肉系統(tǒng)疾病[2]。當(dāng)OP和SP共存時，稱之為肌少-骨質(zhì)疏松癥(osteosarcopenia，OS)[3-6]，即OS同時具有OP和SP的臨床特征。由于目前國內(nèi)外對OS的診斷標(biāo)準(zhǔn)存在爭議，因此文獻報道的發(fā)病率各不相同。Huo等[7]對680名有跌倒史的老年人進行流病學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)OS的患病率為37%，且這些患者更易有其他合并癥，運動能力受損和抑郁風(fēng)險也較高。Yoo等[8]對324例髖部骨折的老年患者研究發(fā)現(xiàn)，OS患者1年死亡率(15.1%)顯著高于僅患OP(5.1%)或SP(10.3%)者。OP引起的脆性骨折(如髖關(guān)節(jié)骨折、腰椎骨折和橈骨遠端骨折等)和SP引起的運動功能障礙、跌倒等相互作用，使OS患者致殘致死率顯著提高，因此，研究OS的發(fā)病機制及防治策略已迫在眉睫。然而相比于OP或SP，目前OS的動物模型構(gòu)建方法報道較少，現(xiàn)有的研究或利用轉(zhuǎn)基因衰老性小鼠或老齡鼠構(gòu)建本病動物模型。本研究基于前期研究基礎(chǔ)，應(yīng)用復(fù)合造模法構(gòu)建OS大鼠模型，以期為OS的基礎(chǔ)研究提供動物模型載體，為研究OS的病因病機及防治策略提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物：SPF級雌性未孕6月齡SD大鼠40只，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：No.44005800009826。實驗在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室(溫度20 ℃～26 ℃，濕度40%～70%，每天交替光照12 h)進行，喂食大鼠專用普通飼料及無菌用水。

1.1.2藥品：地塞米松磷酸鈉注射液(三才石岐制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H44025148，批號20190350)，注射用青霉素鈉(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H37020080，批號190405)。

1.1.3儀器：YLS-13A型大小鼠抓力測定儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司)；Discovery A型雙能X線骨密度儀(美國Hologic公司)；micro CT儀(比利時Scanco Medical)。

1.2 方法

1.2.1動物分組、造模及給藥：40只SPF級健康雌性未孕6月齡SD大鼠在實驗開始之前自由攝取標(biāo)準(zhǔn)動物飲食，適應(yīng)環(huán)境1周，然后利用Excel表格的Rand函數(shù)按體重隨機分層分組，共分5組，即正常組(Control)、假手術(shù)組(Sham)、假手術(shù)+地米組(Sham+DXM)、去勢組(OVX)、去勢+地米組(OVX+DXM)，每組8只。OVX組、OVX+DXM組均采用大鼠背側(cè)入路雙側(cè)卵巢切除法[9]切除大鼠雙側(cè)卵巢，逐層縫合肌肉和皮膚。Sham組、Sham+DXM組切除卵巢附近等體積大小的脂肪組織后逐層縫合肌肉和皮膚。術(shù)后除Control組外，各組大鼠給予青霉素鈉8萬單位/只肌肉注射，每天1次，連續(xù)3 d。各組大鼠術(shù)后恢復(fù)一周，一周后分別對Sham+DXM組、OVX+DXM組大鼠腹腔注射地塞米松磷酸鈉注射液(DXM)1 mg/(kg·d)，連續(xù)2周。術(shù)后3個月麻醉處死各組大鼠，檢測相關(guān)指標(biāo)驗證造模成功。

1.2.2抓力檢測：造模后3個月，使用YLS-13A大小鼠抓力儀測定大鼠前肢抓力(grip)。測試前讓大鼠在抓力儀上適應(yīng)10 min，然后抓住大鼠尾巴，確定大鼠抓牢后，平穩(wěn)地向后拉，記錄儀器上的最大抓力讀數(shù)。測定3次并記錄，用3次抓力的平均值作為反映前肢肌肉力量的指標(biāo)。

1.2.3雙能X線骨密度儀(DXA)檢測：造模后3個月，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，用DXA“小動物”模式中“大鼠全身”和“區(qū)域高分辨率”分別測量大鼠全身骨密度(BMD)、股骨BMD、全身瘦肉量和四肢瘦肉量等。根據(jù)相關(guān)OP指南[9-11]，將全身、股骨等BMD作為確定OP的診斷方法。根據(jù)歐洲肌少癥工作組(EWGSOP)、亞洲肌少癥工作組(AWGS)和國際肌少癥工作組(IWGS)的標(biāo)準(zhǔn)[12-13]，測量大鼠四肢瘦肉量及全身瘦肉量，將相對骨骼肌質(zhì)量指數(shù)(relative skeletal muscle index，RSMI)定義為四肢瘦肉量(appendicular lean mass，ALM)/體重(body weight，BW)，將骨骼肌質(zhì)量指數(shù)(skeletal muscle index，SMI)定義為全身瘦肉量(lean mass，LM)/BW，以大鼠前肢抓力、RSMI和SMI作為確定SP的診斷方法。

1.2.4Micro CT檢測：麻醉處死大鼠后，完整分離大鼠左側(cè)股骨，剔除股骨周圍附著的肌肉等軟組織，多聚甲醛固定，生理鹽水浸泡。測量離體左側(cè)股骨BMD后進行Micro CT掃描。通過儀器自帶分析軟件(CTAn)框取松質(zhì)骨，選擇股骨遠端生長板上方1 mm的松質(zhì)骨作為感興趣區(qū)，分析骨體積分?jǐn)?shù)(percent bone volume，BV/TV，%)、骨表面密度(bone surface density，BS/TV，mm-1)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th，mm)、骨小梁數(shù)(trabecular number，Tb.N，mm-1)和骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp，mm)，并通過儀器自帶分析軟件(CTvox)重構(gòu)股骨遠端三維圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)先進行正態(tài)性與方差齊性檢驗。若方差齊，組間兩兩比較采用LSD法。若方差不齊，先行Welch(W)校正檢驗，然后用Dunnett’s T3(3)法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

實驗過程中，Sham+DXM組大鼠因麻醉引起腸梗阻死亡1只，OVX+DXM組大鼠因腹腔注射時注射器針尖刺穿腸道死亡一只，最終納入研究的動物數(shù)量為38只。

2.2 各組大鼠抓力

造模3個月后，對大鼠前肢抓力進行檢測。與Control組[(1 120.06±206.71) g]相比，Sham組[(1 114.08±130.57) g]大鼠前肢抓力無明顯變化(P>0.05)。與Sham組相比，Sham+DXM組[(927.05±177.72) g]、OVX組[(796.78±168.49) g]和OVX+DXM組[(706.33±138.55) g]大鼠前肢抓力明顯下降(P<0.05)，其中OVX+DXM組大鼠前肢抓力下降最明顯，而OVX組大鼠前肢抓力其次。與Sham+DXM組相比，OVX+DXM組大鼠前肢抓力下降。與OVX組相比，OVX+DXM組大鼠前肢抓力有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 DXA檢測

與Control組相比，Sham組大鼠全身BMD、股骨全段BMD無明顯變化(P>0.05)。與Sham組相比，Sham+DXM組大鼠全身BMD、股骨全段BMD無明顯變化(P>0.05)，說明DXM腹腔注射[1 mg/(kg·d)]不會引起大鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松。與Sham組相比，OVX組和OVX+DXM組大鼠全身BMD、股骨全段BMD均下降(P<0.05)，且OVX+DXM組大鼠下降更明顯，說明OVX組和OVX+DXM組大鼠均發(fā)生骨質(zhì)疏松，其中OVX+DXM組大鼠骨質(zhì)疏松似乎更嚴(yán)重，但兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠全身及股骨全段BMD比較Table 1 BMD of the whole body and femur in each

與Control組相比，Sham組大鼠SMI、RSMI無明顯變化(P>0.05)。與Sham組相比，Sham+DXM組大鼠SMI、RSMI明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明DXM腹腔注射可以引起大鼠骨骼肌肌量下降。與Sham+DXM組相比，OVX組、OVX+DXM組大鼠SMI、RSMI明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與OVX組相比，OVX+DXM組大鼠SMI、RSMI明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明大鼠SMI、RSMI可以區(qū)分兩組大鼠骨骼肌肌量變化，證明造模成功。見表2。

表2 各組大鼠骨骼肌質(zhì)量指數(shù)和相對骨骼肌質(zhì)量指數(shù)Table 2 Skeletal muscle mass index and relative skeletal muscle mass index of rats in each group

2.4 Micro CT檢測

與Control組相比，Sham組大鼠股骨遠端BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp無明顯變化(P>0.05)，BS/TV下降(P<0.05)。與Sham組相比，Sham+DXM組大鼠股骨遠端BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp無明顯變化(P>0.05)，僅BS/TV提高(P<0.05)，說明DXM腹腔注射對股骨遠端骨微結(jié)構(gòu)影響不大。與Sham+DXM組相比，OVX組、OVX+DXM組大鼠股骨遠端BV/TV、BS/TV、Tb.N明顯下降，Tb.Sp明顯提高(P<0.05)，Tb.Th差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠離體股骨遠端骨微結(jié)構(gòu)Table 3 Bone microstructure of isolated distal femur of rats in each group

如圖1所示，Comtrol組、Sham組和Sham+DXM組股骨遠端骨微結(jié)構(gòu)無明顯差別。與前三組相比，OVX組、OVX+DXM組股骨遠端骨量明顯下降，骨小梁稀疏，骨小梁數(shù)目和厚度明顯下降，骨小梁分離度明顯增加，這與上述骨微結(jié)構(gòu)檢測指標(biāo)相一致。

3 討論

OS是以肌力、肌量、肌肉功能下降、BMD降低和骨微結(jié)構(gòu)損害為特征的肌肉骨骼系統(tǒng)疾病[6]。肌肉骨骼位置毗鄰，聯(lián)系密切，相互影響。肌力下降，肌肉功能受損，跌倒風(fēng)險增加，同時肌纖維對骨細(xì)胞的生物力學(xué)刺激降低，引起骨質(zhì)疏松；肌量下降，肌細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子減少，這些細(xì)胞因子不僅可以通過自分泌影響自身，而且通過旁分泌影響緊鄰的骨細(xì)胞，可能加重骨質(zhì)疏松。BMD降低，骨脆性增加，引起骨折風(fēng)險增加；骨量下降，骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子不僅通過自分泌影響自身，而且通過旁分泌影響肌肉[14-18]。因此，OS患者跌倒、脆性骨折及死亡風(fēng)險更高，其發(fā)病機制遠比單一的SP或OP更復(fù)雜。然而，目前針對本病的研究僅僅停留在起步階段，局限于臨床研究[7-8,19-23]，基礎(chǔ)研究少見。本研究基于前期研究基礎(chǔ)，通過復(fù)合造模法構(gòu)建本病動物模型，并嘗試確定本病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，為后續(xù)深入研究提供理論基礎(chǔ)。

目前，OS暫無較成熟的造模方法。國外學(xué)者[24]嘗試?yán)?0月齡SD雌性大鼠去卵巢構(gòu)建OS模型，但這種方法存在動物飼養(yǎng)周期長、老齡大鼠易死亡、評價指標(biāo)片面等問題，并不能有效區(qū)分SP和OP。

目前構(gòu)建OP模型有多種方法[25-28]，包括手術(shù)誘導(dǎo)法、藥物誘導(dǎo)法、失用誘導(dǎo)法、飲食誘導(dǎo)法、基因敲除法和自然退變法等。其中較理想的OP動物模型應(yīng)具有模型穩(wěn)定、可操作性強、造模周期短、重復(fù)性高、應(yīng)用廣泛、經(jīng)濟實用等優(yōu)點。研究證實[26]，雌性SD大鼠經(jīng)手術(shù)切除雙側(cè)卵巢后，體內(nèi)雌激素水平驟然下降，使促黃體素和促卵泡素分泌量增加，從而影響骨代謝，骨吸收遠遠高于骨形成，骨量丟失嚴(yán)重，從而導(dǎo)致了OP。該模型已成為國內(nèi)外研究絕經(jīng)后OP的“金標(biāo)準(zhǔn)”，也是WHO和FDA推薦的研究絕經(jīng)后OP的最佳模型。

目前構(gòu)建SP模型的方法相對較少。常岑等[29-30]對SD大鼠腹腔注射DXM注射液，連續(xù)2周，成功構(gòu)建大鼠骨骼肌萎縮模型。魯飛翔等[31-33]對小鼠皮下注射DXM注射液，連續(xù)6周，成功構(gòu)建小鼠SP動物模型。DXM屬于糖皮質(zhì)激素，具有抗炎、抗過敏和抗休克的功效，但長期注射會導(dǎo)致體重增加、肌肉萎縮、脂肪向心性堆積等不良反應(yīng)。DXM是糖皮質(zhì)激素中效價最高且作用持續(xù)時間最長的一種激素類藥物，因此利用DXM建立SP動物模型具有周期較短且效果明顯等優(yōu)點，并且這種動物模型能較為真實的模擬人類短期應(yīng)用激素后引起的肌肉萎縮。除了注射DXM，高脂飼料喂養(yǎng)大小鼠，也可構(gòu)建SP動物模型[34]。但這種方法普遍存在造模周期長(最長14周)、喂養(yǎng)成本大、高脂飼料配方不統(tǒng)一等問題，難以廣泛應(yīng)用。

綜合上述OP和SP的造模方法，結(jié)合本課題組前期研究基礎(chǔ)，本研究利用6月齡雌性未孕去勢大鼠聯(lián)合腹腔注射DXM，構(gòu)建OS大鼠模型。這種造模方法具有造模周期短(3個月)、模型穩(wěn)定、可操作性強、成本低等優(yōu)點，可以較為真實地模擬OS。

OS目前全球尚無統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但確診該病必須同時滿足SP和OP的診斷標(biāo)準(zhǔn)。OP主要以腰椎、股骨和全髖BMD等為診斷依據(jù)。SP主要以肌量、肌力和肌肉功能為診斷依據(jù)[12-13]。肌量測量常采用雙能X線吸收儀(DXA)和生物電阻抗(BIA)等方法測量全身SMI和RSMI，肌力測量評價優(yōu)勢手的握力，肌肉功能測量評價正常步速。基于此，為確定OS大鼠模型的診斷標(biāo)準(zhǔn)，本研究以大鼠前肢抓力作為評價大鼠肌力的指標(biāo)，以大鼠SMI和RSMI來評價大鼠肌量，以大鼠全身BMD和股骨BMD來評價大鼠骨量，并進一步用Micro CT定量評價大鼠股骨遠端骨微結(jié)構(gòu)，同時構(gòu)建三維圖形，為OS大鼠模型的診斷提供診斷學(xué)依據(jù)。

結(jié)果表明，造模后3個月，與Control組和Sham組相比，Sham+DXM組大鼠前肢抓力明顯降低，SMI和RSMI明顯下降，全身BMD、股骨全段BMD和股骨遠端骨微結(jié)構(gòu)無顯著變化，表明腹腔注射DXM[1 mg/(kg·d)]引起大鼠發(fā)生SP，而不引起大鼠發(fā)生OP。與Control組、Sham組和Sham+DXM組相比，OVX組和OVX+DXM組大鼠前肢抓力明顯下降，SMI和RSMI明顯下降，全身BMD和股骨全段BMD明顯下降，股骨遠端骨微結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，表明去勢、去勢聯(lián)合地米均可引起大鼠發(fā)生OS，但去勢聯(lián)合地米較單純?nèi)菰诮档蚐MI和RSMI方面作用更強烈(見表2)。

綜合以上研究結(jié)果，去勢聯(lián)合腹腔注射DXM法可以建立OS大鼠模型，這種復(fù)合造模法具有造模周期短(3個月)、模型穩(wěn)定、可操作性強、成本低等優(yōu)點，可以較為真實地模擬OS。OS大鼠模型的評價指標(biāo)包括前肢抓力、SMI和RSMI、全身BMD和股骨BMD、股骨遠端骨微結(jié)構(gòu)等，這些指標(biāo)具有測量簡單、方便操作、分辨率高等優(yōu)點，對于本病的診斷具有較高的診斷價值。