納豆提取物對預防骨質疏松作用的研究

蔡鐵全 李瑩 徐建文 曹璨 劉影*

1.國家市場監督管理總局食品審評中心，北京 100070 2.哈爾濱醫科大學，黑龍江 哈爾濱 150001

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性代謝性骨病，其特征是骨量減少，骨的微觀結構退化，使得骨的強度破壞、骨折危險性增加。據統計，在55歲以上女性及65歲以上男性中，因骨相關疾病導致的死亡率和醫療費用在逐年增加[1]。中國是世界老齡人口最多的國家，根據最新的流行病學調查顯示，我國在這方面也存在著較大的問題[2]。由此可見，開展骨質疏松癥防治研究已經到了刻不容緩的地步。

納豆由納豆菌、納豆芽孢桿菌發酵黃豆制成，它的多種功能因子綜合作用于機體，使其具有多種預防疾病和保健的功效。國內外多項研究結果表明，納豆對預防骨質疏松癥具有一定的作用[3-5]。為了進一步對納豆預防骨質疏松作用作具體闡明，本實驗預通過納豆提取物對大鼠的實驗研究，探討納豆提取物預防骨質疏松的作用，為其進一步開發和利用提供實驗室依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1樣品及劑量：納豆提取物。人體推薦劑量為3 g/(人·d)，如成人體重以60 kg計，則每日推薦劑量為0.05 g/(kg·bw)。實驗設低、中、高3個劑量組，劑量分別為0.25、0.5、1.5 g/(kg·bw)，鈣含量分別為0.037 5、0.075、0.225 g/(kg·bw)。相當于人體推薦劑量的5、10、30倍，同時設置低鈣對照組(鈣含量為150 mg/100 g飼料)(灌胃等容積去離子水)和碳酸鈣對照組[劑量為0.56 g/(kg·bw)]，碳酸鈣中鈣含量占40%，因此鈣含量為0.224 g/(kg·bw)。

1.1.2實驗動物及分組：Wistar品系雄性大鼠50只(SPF級，60～75 g，北京維通利華實驗動物有限公司)，參照原衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》2003年版，實驗動物許可證編號：SCXK(京)2012-0001。所有大鼠均在本院清潔級動物實驗中心(屏障環境)飼養[許可證號：SYXK(黑) 2011007]，環境條件保持為12 h晝夜循環，恒溫(21 ℃～23 ℃)，濕度為55%～58%，所有動物實驗期間均給予低鈣飼料[北京科澳協力飼料有限公司，許可證號：SCXK(京)2009-0012]。低鈣飼料配方(g/100 g)：酪蛋白10.0，黃豆粉15.0，小麥粉54.0，花生油4.0，纖維素2.0，AIN-76混合鹽2.6，AIN-76混合維生素1.0，氯化膽堿0.2，DL-蛋氨酸0.2，淀粉11.0。加入CaCO3使飼料鈣含量達到150 mg/100 g，實測鈣含量為141.5 mg/100 g。保證有充足飲水，飲用去離子水，連續3個月。

50只大鼠在實驗室條件下檢疫1周后，隨機分成5組，分別為受試物低、中、高3個劑量組、低鈣對照組、碳酸鈣對照組，每組10只，將各組動物均按10 mL/(kg·bw)灌胃容積進行灌胃。連續灌胃3個月后進行各項指標檢測。

1.1.3儀器及試劑：HOLOGIC Discovery雙能X線骨密度儀(哈爾濱醫科大學第二附屬醫院)、原子吸收分光光度計(AA 7002，北京東西分析儀器有限公司)、動物天平、電子天平、加樣器、試管、離心管、動物解剖器材、游標卡尺、代謝鼠籠、105 ℃烘箱。優級純碳酸鈣、硝酸、高氯酸、氧化鑭、鈣單元素標準溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1體重測定：每周測定體重1次，測定前禁食12 h。

1.2.2股骨重量測定：動物干預結束后處死，采集右側股骨，測量股骨長度；于105 ℃烘箱中烘烤8 h至重量不再變化，冷卻至室溫后，稱量骨干重。

1.2.3股骨骨密度測定：骨密度儀校準后測量股骨中點[測量股骨全長，從而確定其中點(截面)]及股骨遠心端[股骨遠心端關節凹槽最下緣處(截面)]的骨密度。

1.2.4骨鈣含量的測定：準確稱量烤至恒重的股骨整體，放入經鹽酸處理干燥清潔的150 mL三角瓶中，加入硝酸+高氯酸(4∶1)混合酸15～20 mL，在電熱板上加熱消化至冒白煙并透明無色。加數毫升去離子水，煮沸以趕出剩余的酸。重復2次，定容后，用原子吸收分光光度計測定。

1.2.5鈣吸收實驗：給予該樣品3周后，將大鼠置不銹鋼代謝籠中進行3 d鈣代謝實驗，記錄3 d進食量，收集72 h糞便，測定飼料樣品及糞便中的鈣含量。準確稱取飼料(均勻混合后過20目篩)或糞便(均勻混合后80 ℃烘箱中烘干，冷卻后磨細)0.300～1.000 g，經硝酸和高氯酸混合酸消化后，用原子吸收法測定飼料和糞便中鈣含量，計算鈣的吸收率。鈣的表觀吸收率(%)=(攝入鈣-糞鈣)/攝入鈣×100%。

1.3 統計學分析

實驗數據用SPSS軟件進行統計，結果以平均值±標準差表示。各組間均數比較進行t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 納豆提取物對大鼠體重、鈣吸收率的影響

以0.25、0.5、1.5 g/(kg·bw)劑量經口給予大鼠納豆提取物90 d后，高劑量組、碳酸鈣組大鼠的體重顯著大于低鈣對照組，高劑量組的大鼠體重與碳酸鈣對照組相比，顯著大于碳酸鈣對照組，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1～3。

表1 各組大鼠初始體重比較Table 1 Comparison of baseline body weight of the rats

表2 納豆提取物對大鼠體重的影響Table 2 Effect of natto extract on body weight of the rats

表3 納豆提取物對大鼠鈣表觀吸收率的影響Table 3 Effect of natto extract on apparent absorption of calcium in rats

2.2 納豆提取物對大鼠股骨質量和長度的影響

以0.25、0.5、1.5 g/(kg·bw)劑量經口給予大鼠納豆提取物90 d后，各劑量組、碳酸鈣組大鼠的股骨干重均顯著大于低鈣對照組，高劑量組大鼠的股骨干重和骨長與碳酸鈣對照組相比，均不低于碳酸鈣對照組。見表4。

表4 納豆提取物對大鼠股骨質量和長度的影響Table 4 Effects of natto extract on femoral mass and length in rats

2.3 納豆提取物對大鼠股骨骨密度和骨鈣含量的影響

以0.25、0.5、1.5 g/(kg·bw)劑量經口給予大鼠納豆提取物90 d后，高劑量組大鼠的股骨骨密度和骨鈣含量均顯著大于低鈣對照組，且不低于碳酸鈣對照組，差異無統計學意義(P>0.05)。見表5、6。

表5 納豆提取物對大鼠股骨骨密度的影響Table 5 Effect of natto extract on bone mineral density of the rat femur

表6 納豆提取物對大鼠股骨骨鈣含量的影響Table 6 Effect of natto extract on bone calcium content of the rat femur

3 討論

納豆經豆類發酵制成，含有蛋白酶、多種維生素、Y-多聚谷氨酸、Y-谷氨?；D肽酶等營養物質，同時也含有納豆激酶(NK)、超氧化物歧化酶、異黃酮、皂甙素、VK2[6]等生物活性物質。近年來有研究發現，納豆中還有較高含量的支鏈脂肪酸[7]。納豆不僅營養豐富，還具有廣泛的生物學效應，尤其是對于心血管疾病[8-9]和骨質疏松的預防作用以及抗菌[10-11]、抗氧化[12-13]作用在許多報道中被提及。早在1999年Yamaguchi等[14]就曾發現，納豆中的維生素K2對大鼠由于卵巢切除術(OVX)引起的骨質流失具有預防作用。Ono等[15]的研究也證明，納豆提取物中的皂苷和異黃酮對OVX大鼠同樣具有預防骨量流失作用。Ikeda[16]等進行了基于人群的隊列研究，結果顯示納豆的攝取與絕經后女性的骨質流失相關。同時，Kojima[17]等的最新研究發現，習慣性攝取納豆可能與日本絕經后女性的骨質疏松性骨折風險降低有關，提示納豆提取物在預防骨質疏松中可能起到作用。

骨是一個“活”的器官，骨重建是一個終身的過程，舊骨被破骨細胞吸收，新骨由成骨細胞形成，骨量的維持取決于成骨細胞新骨形成與破骨細胞舊骨吸收之間的平衡活動[18]。產生骨質疏松的根本原因就是骨重建的失衡，形成的新骨量少于被吸收骨量，導致骨量的丟失[19]，臨床表現為骨密度降低，骨皮質變薄等[20]。故而骨密度測量被認為是評價骨質疏松程度的客觀量化指標，也是診斷骨質疏松癥的主要依據[21]。以0.25、0.5、1.5 g/(kg·bw)劑量經口給予大鼠納豆提取物90 d后，與低鈣對照組相比，高劑量組大鼠的股骨骨密度顯著升高(P<0.05)，且不低于碳酸鈣對照組(P>0.05)，此結果與Kawano等[22]利用去卵巢大鼠進行研究的結果一致，說明納豆提取物具有一定的預防骨質疏松癥的作用。

骨質疏松癥的臨床表現之一為骨密度降低，而體重則是影響骨密度的因素之一[23]。有研究提出，體重可作為預防骨質疏松發生的重要指標，因為其可能是遺傳、運動、飲食等因素的綜合反映[24]。以0.25、0.5、1.5 g/(kg·bw)劑量經口給予大鼠納豆提取物90 d后，與低鈣對照組相比，高劑量組、碳酸鈣組大鼠的體重顯著升高(P<0.05)，高劑量組大鼠體重與碳酸鈣對照組相比，差異無統計學意義。提示納豆提取物可能通過保持合適體重，從而達到預防骨質疏松的作用。

對于骨骼來說，骨重量及骨長度直接反映了骨的健康程度。以0.25、0.5、1.5 g/(kg·bw)劑量經口給予大鼠納豆提取物90 d后，與低鈣對照組相比，各劑量組、碳酸鈣組的股骨干重均顯著升高(P<0.05)，高劑量組的大鼠股骨干重和骨長與碳酸鈣對照組相比，差異均無統計學意義。Wang等[25]也評估了納豆預防卵巢切除大鼠骨量流失的能力，結果與本研究相似，說明納豆提取物可以增加骨量，從而起到預防骨質疏松的作用。

鈣是人體中最豐富的無機元素，它在人體飲食中的存在有利于骨骼肌的完整性，防止骨質疏松癥[26]。人體中絕大多數的鈣均儲存在骨骼與牙齒中，同時骨骼的形成也需要鈣的參與[27]。以0.25、0.5、1.5 g/(kg·bw)劑量經口給予大鼠納豆提取物90 d后，與低鈣對照組相比，高劑量組大鼠骨鈣含量顯著升高，且不低于碳酸鈣對照組(P>0.05)。高劑量組的鈣吸收率顯著大于碳酸鈣對照組(P<0.05)，說明納豆提取物可能具有促進鈣吸收，促進骨骼生長的作用，進一步提示其在預防骨質疏松癥中可能發揮的作用。

綜上所述，經口給予大鼠不同劑量的納豆提取物90 d，實驗組大鼠的股骨的骨密度、骨鈣含量顯著高于低鈣對照組且不低于碳酸鈣對照組，鈣吸收率不低于碳酸鈣對照組，因此認為納豆提取物可能通過促進鈣吸收增加骨量，提示其在預防骨質疏松癥中可能發揮的作用。