異常凝血酶原對肝癌合并門靜脈癌栓的預測價值

童敬澍，馬浙平，毛書奇，盧長江，陸才德

（寧波大學附屬李惠利醫院 肝膽胰外科，浙江 寧波 315040）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是目前世界上第五大常見的惡性腫瘤，全球每年新增HCC近70 萬人，其中50%發生在我國，其病死率在我國惡性腫瘤中位列第二[1]。門靜脈癌栓（portal vein tumor thrombosis，PVTT）作為HCC最常見的并發癥之一，是引起HCC患者肝功能減退、門靜脈高壓、腫瘤轉移復發的重要原因，伴有PVTT的HCC患者自然病程僅為3個月，預后較差[2]。異常凝血酶原（protein induced by vitamin K absence or antagonist-II，PIVKA-II）是在肝癌細胞中，因凝血酶原前體羧化不足產生的蛋白質。研究發現PIVKA-II在HCC的增殖、血管浸潤和轉移過程中發揮作用，并與微血管侵犯（MVI）獨立相關[3]。然而PIVKA-II與PVTT大血管的關系尚不明確，本研究旨在探究PIVKA-II與PVTT的關系，及其在HCC患者發生PVTT的預測價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

回顧性收集自2019年9月至2020年12月寧波大學附屬李惠利醫院肝膽胰外科收治的206例HCC患者臨床資料，按照納入排除標準，最終有191例患者納入本研究，如圖1。納入標準：（1）依據《原發性肝癌診療規范（2019年版）》[4]確診為HCC；（2）于我院行一次及以上腹部增強CT或MRI平掃，并且行一次及以上血清PIVKA-II、D-二聚體、AFP、AFP-L3、血常規、生化全套檢測。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）行HCC根治術后腫瘤復發；（3）伴其他全身嚴重疾病；（4）長期服用華法林、維生素K及其拮抗劑。本研究通過醫院倫理委員會審批（審批號：KY2020PJ125）。

1.2 PVTT診斷和分型評估

本組HCC患者的PVTT通過腹部增強CT或MRI診斷，所有影像資料均由兩位及以上具有副高以上年資的影像科醫師判讀。PVTT的分型按照程氏分型標準：I型，癌栓侵及肝葉或肝段的門靜脈分支；II型，癌栓侵及門靜脈左或右支；III型，癌栓侵及門靜脈主干；IV型，癌栓侵犯及腸系膜上靜脈[5]。

1.3 分組和內部驗證方法

為研究PIVKA-II對HCC患者發生PVTT的預測價值并確定其最佳截斷值，本研究采用隊列內部驗證方法，即所有HCC患者按照3∶2的比例隨機分為試驗組和驗證組，在試驗組中計算PIVKA-II和D-二聚體的最佳截斷值，并在驗證組中驗證其預測PVTT的價值，見圖1。

圖1 分組方法及設計思路示意圖

1.4 檢驗儀器與標本處理

使用μTASWako i30全自動電泳熒光免疫分析儀（日本）及配套檢測試劑盒（富士膠片和光純藥株式會社）檢測所有HCC患者的血清PIVKA-II、甲胎蛋白（AFP）、甲胎蛋白異質體（AFP-L3）；其余相關血液指標包括白蛋白（ALB）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰轉肽酶（GGT）、總膽紅素（TBIL）、凝血酶原時間（PT）、凝血功能國際標準化比值（INR）。所需的血液標本均在HCC患者進行手術、介入或化療前空腹時采集，并經過3 500 r/min離心10 min分離血清，且在2 h內完成各指標檢驗。

1.5 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行分析：各數據正態性采用Kolmogorov-Smirnov法檢驗，符合正態分布的計量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗；非正態分布的計量資料采用M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征曲線（receiver operation curve，ROC）評估PIVKA-II和D-二聚體對HCC患者發生PVTT的預測價值并計算其最佳截斷值。采用Logistic回歸分析HCC患者發生PVTT的危險因素。采用Spearman等級相關檢驗分析PIVKA-II與PVTT程氏分型等級的相關性。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 試驗組和驗證組的基線資料

試驗組和驗證組之間基線特征差異無統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 試驗組和驗證組的基線資料及比較

2.2 試驗組和驗證組內有PVTT與無PVTT之間比較分析

分別比較兩組臨床資料，伴有PVTT 的患者PIVKA-II、AFP、AFP-L3、D-二聚體水平高于無PVTT的患者，差異有統計學意義（表2，圖2）。

圖2 試驗組和驗證組有PVTT與無PVTT之間PIVKA-II的差異比較

表2 試驗組和驗證組內伴有PVTT與無PVTT之間臨床資料比較

2.3 試驗組中研究PIVKA-II和D-二聚體對HCC患者發生PVTT的預測價值并確定其最佳截斷值

在試驗組HCC 患者中，繪制ROC 曲線研究PIVKA-II和D-二聚體對合并PVTT的預測價值（圖3）。PIVKA-II的ROC曲線下面積為0.747（95%CI0.652～0.842，P＜0.001），PIVKA-II預測HCC患者發生PVTT的最佳截斷值為426.5 mAU/mL，敏感度為78.8%，特異度為69.8%；D-二聚體ROC曲線下面積為0.828（95%CI0.751～0.904，P＜0.001），D-二聚體預測HCC患者發生PVTT的最佳截斷值為286 μg/L，敏感度為78.8%，特異度為77.8%；PIVKA-II與D-二聚體兩者聯合檢測的ROC曲線下面積為0.861（95%CI0.791～0.932，P＜0.001），在PIVKA-II與D-二聚體各自最佳截斷值下，兩者聯合預測HCC患者發生PVTT的敏感度為90.4%，特異度為57.1%。兩者聯合預測發生PVTT的敏感度較單一指標均有所提高，但特異度下降。

圖3 試驗組中PIVKA-II和D-二聚體對HCC患者發生PVTT的預測價值

2.4 驗證組中驗證PIVKA-II和D-二聚體對HCC患者發生PVTT的預測價值并驗證其最佳截斷值

為驗證PIVKA-II和D-二聚體對HCC患者發生PVTT的預測價值并驗證其上述最佳截斷值，在驗證組中通過繪制ROC曲線驗證。PIVKA-II的驗證組ROC曲線下面積為0.802（95%CI0.693～0.911，P＜0.001），將PIVKA-II以試驗組中確定的426.5 mAU/mL為界，其預測HCC 患者發生PVTT 的敏感度為79.4%，特異度為69.0%；D-二聚體的驗證組ROC曲線下面積為0.894（95%CI0.825～0.963，P＜0.001），將D-二聚體以試驗組中確定的286 μg/L為界，其預測HCC患者發生PVTT的敏感度為88.2%，特異度為76.2%；在各自最佳截斷值下，兩者聯合預測發生PVTT的敏感度為94.5%，特異度為57.1%，兩者聯合檢測來預測PVTT的敏感度較單獨檢測有所提高。

2.5 HCC患者發生合并PVTT的危險因素分析

將本研究中伴有PVTT的HCC患者與無PVTT的HCC患者對比，單因素分析顯示：PIVKA-II≥426.5 mAU/mL、AFP≥20 ng/L、AFP-L3 ≥10%、ALB≥30 g/L、ALT≥40 U/L、D-二聚體≥286 μg/L是發生PVTT的獨立危險因素；多因素分析顯示，PIVKA-II≥426.5 mAU/mL、D-二聚體≥286 μg/L是HCC患者發生PVTT的獨立危險因素，見表3。

表3 HCC患者發生PVTT的單因素、多因素分析

2.6 合并PVTT的HCC患者血清PIVKA-II水平與PVTT的程氏分型等級呈線性相關

本研究共86 例伴有PVTT的HCC患者中，患者PVTT分型等級越高，其血清PIVKA-II水平也相應增高，兩者呈線性相關（相關系數=0.400，P＜0.001），見圖4。

圖4 PIVKA-II水平與PVTT的程氏分型等級關系

3 討論

由于肝臟解剖特點和HCC生物學特性，HCC極易侵犯肝血管系統，包括門靜脈主干分支的大血管和肝段以上的小血管系統。PVTT是HCC常見的大血管侵犯形式，其發生率在HCC患者中占40%以上，發生PVTT的HCC患者預后極差[6]，及時診斷或預測PVTT是改善HCC患者預后的重點。本研究重點探究PIVKA-II與HCC患者發生PVTT的關系，研究發現，即使是在PIVKA-II水平普遍升高的HCC患者中，PVTT患者與無PVTT患者之間的PIVKA-II水平差異仍有統計學差異，雖然這種差異也體現在AFP和AFP-L3 上，但多因素分析顯示僅PIVKA-II的差異有意義，這表明不僅是腫瘤本身，而且是PVTT與PIVKA-II的內在關聯引起的PVTT患者PIVKA-II升高。目前關于PIVKA-II與血管侵犯的研究表明，PIVKA-II通過與生長因子受體c-Met結合并激活蛋白酪氨酸激酶1（JAK1）、VEGF、表皮生長因子受體（EGFR）等一系列下游信號通路，誘導HCC增殖和血管浸潤，并導致MVI[7-8]。因此，用PIVKA-II預測PVTT具備理論基礎，但其深入的內在相關腫瘤生物學機制仍待進一步研究。

PIVKA-II作為HCC的新一代腫瘤標志物，其優勢正在逐步體現。臨床上將PIVKA-II≥40 mAU/mL作為診斷HCC的標準，但尚無診斷或預測PVTT的標準。本研究發現PIVKA-II≥426.5 mAU/mL是HCC患者發生PVTT的獨立危險因素，并且用該標準預測PVTT的靈敏度達78.8%。目前PVTT的診斷主要依靠CT、MRI等影像學檢查，但由于影像學檢查只能檢測到肝葉門靜脈分支以下的大血管PVTT，對于肝段及以上更細小的門靜脈分支PVTT只能根據顯微鏡下的病理學檢查，此外影像學檢查普遍具有費用昂貴、易漏診誤診等自身局限性，其診斷PVTT的敏感度僅在70%左右[9]，因此用PIVKA-II來協助診斷或預測PVTT具有臨床價值。早在2007年，我國的程樹群教授首次提出了PVTT的程氏分型，并為之后PVTT的相關研究奠定基礎，目前臨床上根據HCC患者的腫瘤和PVTT的大小、位置情況，采取對應的個性化治療，如根治性手術、經肝動脈化療栓塞（TACE）、射頻消融、放療、免疫靶向治療等[10]，因此精準、有效、及時地評估HCC患者的PVTT情況十分重要。本研究發現，PIVKA-II的升高程度與PVTT程氏分型等級存在線性相關，提示PIVKA-II越顯著升高的HCC患者，更需謹慎評估治療PVTT，以減少相關并發癥，改善患者預后。

國外的一項大樣本回顧性研究表明，AFP≥20 000 ng/mL是診斷HCC合并PVTT的截斷值，但其敏感度僅為24%，診斷效能并不理想[11]。HCC新型標志物miRNA的圖譜研究表明，雖然miRNA可以提示HCC的靜脈侵犯，但miRNA并不能診斷或預測PVTT的發生[12]。目前尚無診斷PVTT的特定腫瘤標記物，本研究從PIVKA-II的理論基礎出發，研究PIVKA-II對PVTT的預測價值，旨在填補這一空缺。此外本研究發現作為反應血液高凝狀態指標的D-二聚體也是PVTT形成的獨立危險因素，可以與PIVKA-II聯合預測PVTT。對于這一現象研究者認為，在PVTT形成過程中，門靜脈局部血液呈高凝狀態，從而引起D-二聚體的反應性升高。PIVKAII聯合D-二聚體可以將預測PVTT的敏感度提高至90.4%，但特異度降至57.1%，考慮到延誤診治PVTT將導致不良后果，敏感度比特異度更為重要，應盡量提高預測PVTT的敏感度。因此，即便目前尚缺乏支持D-二聚體預測PVTT的理論依據，仍可將D-二聚體作為聯合預測PVTT的補充指標，國外一項回顧性研究表明PIVKA-II、D-二聚體與PVTT相關聯（以PIVKA-II≥221.3 mAU/mL為界，靈敏度為83.7%），其結果也支持本研究的結論[13]。

為確定PIVKA-II預測PVTT的最佳截斷值并減少統計偏倚，本研究采取隨機分組的內部驗證思路方法，即先在試驗組中計算得PIVKA-II ≥426.5 mAU/mL是預測PVTT的最佳截斷值，并在驗證組中驗證其靈敏度為79.4%，證明該截斷值的可靠性。該方法在類似研究中主要采取外部驗證，但外部驗證在本研究中并不適用，一是由于樣本量的限制，二是由于本研究主要探討PIVKA-II而非多種變量。研究者在表1 中將試驗組和驗證組的基線資料進行對比，以增加本研究隨機分組內部驗證的科學性。本研究為單中心回顧性研究，存在局限性，相關結果仍需多中心、大樣本隨機對照、外部驗證進一步研究。

綜上所述，HCC患者PIVKA-II≥426.5 mAU/mL是發生PVTT的獨立危險因素，PIVKA-II具有良好的預測PVTT的價值。