MOB1蛋白通過調控AKT/Cyclin D1信號通路促進肝癌細胞增殖

陳建林，陶江濤，帥建，艾小江，鄭錦鋒，余小舫，肖凌云，凌云志，曾小斌

（深圳市人民醫(yī)院龍華分院，廣東 深圳 518109，1.普外科，3.中心實驗室；深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳518020，2.肝膽外科，4.感染病科）

肝癌是我國第4 位常見惡性腫瘤及第2 位腫瘤致死病因。研究顯示，2018 年全球共有841 080 例新發(fā)肝癌病例[1]，其中肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最主要的原發(fā)性肝癌種類，占比85%～90%[2]。肝癌具有起病隱匿、進展快、復發(fā)早、預后差等臨床特點，在過去幾十年的發(fā)展中，盡管有部分針對肝癌的治療方法及藥物出現(xiàn)，但是肝癌的耐藥強、進展快及復發(fā)率高等問題并未解決，患者5年生存率僅約32.5%，嚴重威脅人類健康[3]。究其原因，人們對肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制并不十分清楚。因此，尋找肝癌相關基因，對于理解發(fā)病機制及尋找早期診斷和治療的分子標志物均具有重要意義。

Hippo信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關的重要通路。Hippo信號通路在進化中高度保守，當細胞處于高密度生長或營養(yǎng)缺乏的環(huán)境中時，Hippo信號通路即被激活，MST激酶（mammalian sterile 20-like kinase）被磷酸化，在MOB1（Mps One Binder kinase activator protein 1，Mps一結合者激酶激活因子樣1）蛋白的輔助下，磷酸化下游的LATS蛋白（large tumor suppressor kinases）；隨后，激活的LATS蛋白磷酸化轉錄共激活因子YAP蛋白（Yes-associated protein）和TAZ蛋白（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif），限制其入核，降低Hippo通路下游靶基因的轉錄，包括CTGF、CYR61、ITGAV等多個被報道與腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移密切相關的基因[4]。經(jīng)典的Hippo-YAP/TAZ信號通路被證明是促進肝癌發(fā)生發(fā)展的關鍵調控通路[5]，YAP蛋白高表達是肝癌發(fā)生的早期事件，對于腫瘤的形成至關重要[6]。YAP蛋白的表達水平與肝癌的Edmondson-Steiner分級、血清甲胎蛋白水平及預后顯著相關，是肝癌重要的獨立預后指標[7]。YAP和TAZ蛋白能促進肝癌的侵襲和轉移[8]。此外，Hippo-YAP/TAZ通路還能影響肝癌的耐藥性，如過表達YAP蛋白能促進肝癌的索拉非尼耐藥[9]。相反，MST和LATS蛋白在肝癌中主要扮演抑癌的角色，如MST1/2 缺失能夠大幅降低YAP蛋白的S127 位磷酸化，促進其入核，并促進肝癌細胞的生長[10-11]。

在Hippo信號通路中，MOB1蛋白的功能研究相對較少，已報道的大部分研究指出MOB1 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演抑癌的角色，但其作用尚存在爭議[12]。人MOB1 蛋白包括兩個序列高度相似的同源蛋白MOB1a和MOB1b，兩者之間有96%的相同序列。在結直腸癌中，MOB1 在腫瘤組織中顯著低表達，與淋巴轉移及預后不良相關，且過表達MOB1 能夠顯著抑制結直腸癌細胞系的增殖、遷移能力[13]。泛素連接酶Praja2通過促進MOB1蛋白的降解，促進膠質母細胞瘤的生長[14]。MOB1a/1b基因雙敲除會造成胚胎致死性，但MOB1aΔ/+1btr/tr和MOB1aΔ/Δ1btr/+小鼠相比于對照小鼠MOB1aΔ/+1btr/+更易形成包括肝癌在內的各種自發(fā)性腫瘤[15]。然而也有研究指出，MOB1蛋白能促進腫瘤的侵襲和復發(fā)，且可能在不同的腫瘤類型中發(fā)揮不同的功能。在支氣管肺泡上皮細胞條件性MOB1a/b雙敲除的小鼠中，其肺部并未形成自發(fā)肺腺癌，且尿烷誘導的肺腫瘤發(fā)生率下降[16]。MOB1 在51.2%的非小細胞肺癌組織中高表達，且MOB1 高表達與患者生存期縮短密切相關；進一步研究發(fā)現(xiàn)，MOB1 蛋白能夠促進肺癌細胞的侵襲能力[17]。在肝癌中，MOB1蛋白對于腫瘤的生成、增殖、侵襲及遷移的影響并未得到系統(tǒng)性研究。本研究將利用生物信息學探索MOB1基因在肝癌組織中的表達情況，并分析MOB1 高表達與患者生存期之間的關系；收集肝癌臨床組織樣本，利用Western blotting驗證MOB1蛋白的表達水平；在MOB1敲低及過表達肝癌細胞系中，研究MOB1 蛋白對細胞增殖及細胞周期的影響，并用Western blotting檢測相關信號通路蛋白的變化，探索MOB1蛋白在肝癌中的作用。

1 材料和方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取肝癌表達譜及生存數(shù)據(jù)，包括50例正常樣本及371例腫瘤樣本。統(tǒng)計正常樣本與腫瘤樣本中MOB1a和MOB1b的表達量并分析其表達。使用UALCAN數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu）在線分析MOB1與生存預后的關系。

1.2 樣本收集

本研究獲得深圳市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的審查和批準（LL-KY-2019422），且已取得所有受試者本人簽署的知情同意書。28例肝癌組織及癌旁組織來自深圳市人民醫(yī)院手術切除標本（收集時間自2020年1月至2020年12月），其中包括15例肝細胞性肝癌（HCC）、5 例肝內膽管癌、3 例肝血管癌、1 例肝細胞腺癌、2例纖維性肝癌、1例直腸癌肝轉移、1例乳腺癌肝轉移，所有樣本均有明確的病理診斷報告。將每例患者的癌旁組織與癌組織進行配對研究，樣本取得后，立即切成小塊分裝，并儲存于液氮中，直至使用。取50 mg左右的組織，加入含蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑的強效RIPA緩沖液，在冰上進行高速研磨裂解后，12 000 g離心15 min，取上清進行蛋白定量，并加入SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸15 min后于-80 ℃儲存。

1.3 細胞培養(yǎng)及細胞活力測定

人肝癌細胞系Huh7和HepG2培養(yǎng)于含10%胎牛血清及1%青霉素/鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中，置于含5% CO2的37 ℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。在細胞增殖實驗中，將Huh7和HepG2細胞分別以2.5×103、5×103個/孔的密度接種于96孔板中進行培養(yǎng)，于24、48、72、96 h加入10%的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h，測定450 nm處吸光值并計算細胞活力。

1.4 siRNA敲低

MOB1a和MOB1b的siRNA及陰性對照NCsiRNA由上海吉瑪生物科技公司設計及體外合成。序列如下表1所示。轉染前1 d取對數(shù)生長期肝癌細胞傳代于6 孔板或96 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用GP-transfect-Mate試劑按照說明書進行轉染。

表1 雙鏈siRNA序列

1.5 MOB1a過表達細胞系構建

利用慢病毒介導的過表達質粒pLVX-3Flag-puro構建穩(wěn)定過表達的細胞系。將全長的人MOB1a的編碼序列克隆至pLVX-3Flag-puro質粒中，測序確定序列正確性。將psPAX2和pMD2.G及目的質粒共轉染至293T細胞中進行病毒包裝，于48 h和72 h收集含病毒液上清，并用0.45 μm的濾膜過濾。將病毒液加入至目的細胞中，轉染48 h后用puromycin進行篩選，建立穩(wěn)定轉染細胞系。用pLVX-3Flag-puro載體轉染的細胞作為對照。利用Western blotting鑒定Flag-MOB1a的過表達效果。

1.6 細胞周期檢測

用0.25%胰酶-EDTA溶液消化細胞后，離心收集細胞，用PBS清洗1 次，隨后用預冷的70%乙醇溶液過夜固定細胞，最后加入100 mg/L RNaseA和50 mg/L PI溶液，置于37 ℃孵育30min，用40 μm濾膜過濾后用流式細胞儀檢測細胞周期的變化情況。

1.7 蛋白表達量檢測

采用Western blotting法。取等量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，隨后通過濕法電泳轉移方法將蛋白轉移至0.45 μm的PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶封閉1 h。加入一抗溶液在室溫孵育1 h或在4 ℃孵育過夜，用TBST洗膜3次。再加入HRP標記的二抗，繼續(xù)在室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，然后用ECL化學發(fā)光試劑盒進行顯影。

1.8 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（）表示，多組均數(shù)之間采用單因素方差分析進行比較，進一步兩兩比較采用SNK（Student-Newman-Keuls）-q檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中MOB1在肝癌中高表達

對TCGA數(shù)據(jù)庫樣本進行研究發(fā)現(xiàn)，MOB1a和MOB1b兩個基因在肝癌組織中mRNA表達水平均呈顯著上調（圖1A和1C）。隨后進行預后生存分析，將樣本分為MOB1高表達組和MOB1低表達組，結果顯示MOB1a和MOB1b兩個基因高表達組的生存率均顯著下降（圖1B和1D）。以上結果提示，MOB1高表達促進了肝癌的發(fā)生發(fā)展，且表達量越高，預后越差。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析MOB1 mRNA表達水平及其與肝癌的關系

2.2 在臨床組織樣本中驗證MOB1在肝癌中高表達

提取肝癌組織及配對癌旁組織的總蛋白，利用Western blotting檢測MOB1蛋白表達水平。本研究中，臨床組織樣本涉及的28例患者基本信息見表2和表3。MOB1在13例HCC樣本（13/15，86.7%）和7例其他類型肝癌樣本（7/13，53.8%）中高表達，結果如表4所示。此外，與其他類型肝癌相比，MOB1蛋白相對表達量在HCC的組織樣本中顯著升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 臨床組織樣本中MOB1蛋白的表達水平

表2 臨床樣本庫中15例HCC患者的基本信息（例）

表3 臨床樣本庫中13例其他類型肝癌患者的基本信息（例）

表4 MOB1在腫瘤樣本中的表達情況統(tǒng)計

2.3 MOB1 蛋白過表達促進肝癌細胞增殖并增加G2/M期細胞比例

MOB1a與MOB1b蛋白具有高度同源性，MOB1a基因在肝癌細胞中表達量大于MOB1b基因。因此，后續(xù)實驗選擇MOB1a基因作為MOB1 的代表進行研究。Western blotting結果表明，在Huh7 和HepG2 細胞中，穩(wěn)定過表達細胞系Flag-MOB1a構建成功（圖3A和3D）。相比于空載對照組（pLVX），F(xiàn)lag-MOB1a組的細胞增殖能力（圖3B和3E）與G2/M期的細胞比例（圖3C和3F）均明顯上升（P＜0.05）。上述結果表明，MOB1 的表達與肝癌細胞的增殖呈正相關。

圖3 MOB1蛋白過表達對Huh7和HepG2細胞增殖和細胞周期的影響

2.4 MOB1蛋白低表達抑制細胞增殖及降低G2/M期細胞比例

為了進一步探究MOB1蛋白與肝癌細胞增殖的關系，本研究先采用siRNA下調Huh7和HepG2細胞中MOB1 的表達，然后采用CCK-8 方法檢測MOB1的低表達對Huh7和HepG2細胞增殖的影響。Western blotting檢測結果顯示：與對照組相比，轉染MOB1 siRNA的細胞MOB1 的蛋白表達明顯受到抑制（圖4A和4D，P＜0.05），表明MOB1 的干擾效率顯著。同時，Huh7 和HepG2 細胞的增殖速度亦顯著被抑制（圖4B和4E，P＜0.05）。細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，與NC-siRNA肝癌細胞相比，MOB1低表達能顯著降低G2/M期細胞比例（圖4C和4F）。

2.5 MOB1 蛋白低表達能顯著降低Cyclin D1 及p-AKT表達水平

MOB1 是一種重要的細胞周期調節(jié)因子，然而MOB1蛋白低表達導致肝癌細胞增殖速度降低是否通過影響細胞周期還有待探究。如圖4 所示：與對照組相比較，G2/M期肝癌細胞比例隨MOB1蛋白表達下調顯著下降，提示MOB1低表達可能導致Huh7和HepG2細胞周期阻滯，進入M期進行有絲分裂的肝癌細胞數(shù)量減少（圖4D，4H）。通過蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，MOB1低表達可導致Cyclin D1表達下降；反之，MOB1過表達使Cyclin D1表達升高（圖5）。眾所周知，細胞周期調節(jié)蛋白是細胞周期進程的重要調控因子，因此上述結果表明MOB1 低表達可通過調節(jié)關鍵的細胞周期調節(jié)因子導致肝癌細胞周期停滯。

圖4 MOB1蛋白敲低表達對Huh7和HepG2細胞增殖和細胞周期的影響

在經(jīng)典的Hippo-YAP信號通路中，MOB1 蛋白主要作為接頭蛋白介導MST1/2激酶和LATS1/2激酶之間信號轉導，這一系列事件最終導致YAP的S127磷酸化，抑制其入核[18]。然而本研究發(fā)現(xiàn)，在Huh7和HepG2細胞中，MOB1過表達或敲低表達時，YAP的S127磷酸化水平均無明顯變化。在檢測其他與細胞周期相關的信號通路蛋白時發(fā)現(xiàn)，AKT的Ser473磷酸化水平與MOB1表達水平呈正相關（圖5）。因此，在肝癌細胞中，蛋白MOB1 可能不是通過Hippo-YAP信號通路而是通過AKT信號通路來調節(jié)細胞周期的。

圖5 MOB1蛋白過表達及敲低表達對Huh7細胞及HepG2細胞相關信號通路的影響

3 討論

MOB1 作為細胞周期調節(jié)因子，在多種腫瘤中呈低表達，扮演著抑癌的角色，但其作用尚存在爭議[19]。關于MOB1 是否參與肝癌細胞的生物學作用，國內外尚缺乏相關報道。本研究首先通過檢索TCGA數(shù)據(jù)庫，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)MOB1a和MOB1b的mRNA表達水平在肝癌組織中均顯著上升，且MOB1的高表達與患者的生存率下降顯著相關。同時，在肝癌臨床組織樣本中，MOB1蛋白顯著高表達。本研究通過在Huh7和HepG2細胞內過表達MOB1蛋白，發(fā)現(xiàn)細胞的增殖速率變快，且處于分裂期的細胞比例顯著升高；反之，MOB1蛋白敲低后，處于分裂期的細胞比例顯著降低。這些結果說明，MOB1蛋白可能通過調控細胞周期扮演著促進肝癌發(fā)生發(fā)展的角色。

Cyclin D1是一種重要的細胞周期調控因子，在癌癥的發(fā)病機制中發(fā)揮核心作用。在正常細胞中，Cyclin D1的表達水平受到嚴格的調控；相反，在癌癥中其活性以各種方式增強[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，MOB1低表達能下調Cyclin D1的表達。因此，MOB1蛋白可能通過調控Cyclin D1蛋白表達影響肝癌的細胞周期及細胞增殖。

現(xiàn)有的研究主要報道MOB1蛋白是一種細胞內的輔調節(jié)蛋白，即MOB1 直接與蛋白激酶結合，然后影響其與上下游其他蛋白的相互作用，如在Hippo-YAP信號通路中介導MST1/2 及LATS1/2 蛋白之間的信號轉導[19]。在鼠和果蠅中，MOB1 蛋白缺失會造成胚胎致死或嚴重畸形；然而，在人HEK293A細胞中，MOB1 蛋白敲除細胞依然能夠存活，但Hippo通路的信號轉導受到了影響，如在血清饑餓的處理下YAP蛋白的磷酸化顯著下降，這說明MOB1在HEK293A細胞中能促進YAP蛋白的磷酸化，調控經(jīng)典的Hippo-YAP通路[21]。在Huh7和HepG2細胞中，MOB1蛋白過表達及敲低后，YAP的S127位磷酸化水平無明顯變化；但是，MOB1 蛋白的過表達能夠激活AKT蛋白磷酸化。YAP蛋白是Hippo信號通路的效應因子，YAP蛋白的磷酸化是其入核調控下游基因轉錄的開關機制[22]。在肝癌中，激活的AKT蛋白被證明能控制肝癌細胞的增殖和凋亡，影響肝癌的分化及轉移，如利用LY294002處理抑制AKT蛋白S473位點磷酸化，能誘導細胞周期阻滯，顯著增加G0/G1期細胞比例，降低增殖及周期相關蛋白CDK2、CDK4、Cyclin D1、Cyclin D3、Cyclin E、Cyclin A的表達水平[23]。因此，本研究認為，MOB1 可能通過調控AKT/Cyclin D1 信號通路影響肝癌細胞周期和細胞增殖。

綜上所述，MOB1 蛋白在肝癌中并不是傳統(tǒng)意義上的抑癌基因，相反在肝癌組織中顯著高表達。因此，MOB1可能作為一個促癌基因，調節(jié)細胞周期，參與肝癌的進展，具有重要的臨床意義。